宿主转录标志物GBP5、DUSP3和KLF2的研究进展

结核病依旧是全球特别是发展中国家重要的公共卫生问题,严重威胁着人类的健康,为实现世界卫生组织2035年“终止结核病”的目标,人们迫切需要新型、快速、准确、价格低廉的结核病诊断和监测治疗反应的技术。研究表明,基因宿主转录标志物鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein5,GBP5)、双特异性磷酸酶3(dual specificity phosphatase3,DUSP3)、Krüppel样转录因子2(Krüppel-like transcription factor2,KLF2)可改善结核病的临床诊断并用于结核病治疗监测。为更好地认识其临床意义,笔者从GBP5、DUSP3和KLF23基因宿主转录标志物的发现、发展、临床价值和局限性等方面进行综述,以供读者参考借鉴。

鸟苷酸结合蛋白5在牛分枝杆菌诱导巨噬细胞极化过程中的作用

【背景】牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是重要的人畜共患病原体,严重危害公共卫生安全。巨噬细胞是牛分枝杆菌感染的主要效应细胞,M1型巨噬细胞极化对于宿主免疫防御M. bovis感染至关重要。【目的】探讨鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5, GBP5)对M. bovis感染的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞M1、M2型极化的影响,以及GBP5在M. bovis感染中的作用。【方法】通过前期转录组学数据分析筛选出差异基因GBP5,通过体内、体外验证M. bovis感染后的GBP5的表达水平。小干扰RNA下调细胞内GBP5表达,分别利用RT-q PCR、Western blotting和流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞表面标志物表达变化;平板菌落计数法检测GBP5对M. bovis在巨噬细胞中复制的影响;双荧光素酶报告基因试验检测GBP5对信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)转录调控;Western blotting检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制后STAT3的磷酸化情况。【结果】GBP5在M. bovis感染的RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠组织中表达增加;下调GBP5后细胞内细菌CFU在感染后不同时间点均显著增加,ROS释放减少,M1型巨噬细胞表面标志物表达减少,但是对M2型巨噬细胞无显著影响;下调GBP5后抑制了STAT3的转录启动。ROS的产生抑制了STAT3的磷酸化。【结论】GBP5促进ROS的产生,调控ROS/STAT3通路,促进巨噬细胞向M1型极化,从而抑制细胞内牛分枝杆菌的存活。

人鸟苷酸结合蛋白5基因启动子核心调控区域的鉴定及其转录活性分析

目的构建人鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein 5,GBP5)基因启动子不同长度截短片段的荧光素酶报告基因质粒,通过分析启动子不同截短片段的转录活性,确定其核心调控区域。方法PCR扩增GBP5基因启动子序列,将启动子序列截短为5个不同长度的片段,连接至载体pGL3-basic,构建重组质粒pGL3-GBP5-11/21/31/41/51。将各重组质粒转染至293FT细胞,检测荧光素酶活性;利用JASPAR软件预测GBP5启动子区域的转录因子结合位点,依据预测结果选取靶向核心调控区域的阴阳转录因子1(Yin-Yang transcription factor 1,YY1)进行转录调控活性验证;PCR扩增YY1的CDS序列,构建过表达质粒pIRES2-EGFP-YY1;将pIRES2-EGFP-YY1、pGL3-GBP5-21(-1623~+47 bp)质粒与内参质粒pRL-CMV共转染至293FT细胞,检测荧光素酶活性,分析转录因子YY1对GBP5启动子活性的调控作用。结果菌落PCR、双酶切鉴定证明人GBP5基因启动子报告基因质粒构建正确;JASPAR软件预测GBP5启动子区域存在STAT1、YY1、Foxp3等多个转录因子结合位点;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3-GBP5-21(-1623~+47 bp)启动子活性最高,而pGL3-GBP5-41(-520~+47 bp)启动子活性明显降低,提示GBP5启动子核心区域位于5’UTR上游-1623~-520 bp区域;过表达YY1能明显激活GBP5启动子活性,调控GBP5表达。结论人GBP5基因启动子的核心调控区域位于GBP5启动子5’UTR上游-1623~-520 bp区域,该区域存在转录因子YY1结合位点,YY1过表达能显著影响GBP5启动子活性。

巨噬细胞鸟苷酸结合蛋白5在新孢子虫感染中的作用

探究新孢子虫感染对小鼠腹腔巨噬细胞鸟苷酸结合蛋白(mGBPs)表达的影响,以及mGBP5在新孢子虫感染中的作用。将新孢子虫速殖子感染小鼠腹腔巨噬细胞后,通过RT-PCR和Western blot检测,筛选出上调表达的mGBPs,构建pcDNA3.1-mGBP5真核表达载体并转染293T细胞,再通过Western blot验证mGBP5蛋白的过表达,最后感染新孢子虫并采用荧光定量PCR检测虫体数量。结果显示,新孢子虫感染引起mGBP1-mGBP11 mRNA表达水平升高,且mGBP5蛋白表达水平显著升高,并可诱导细胞质内散在分布的mGBP5向新孢子虫的纳虫泡膜聚集;成功构建pcDNA3.1-mGBP5真核表达载体并能够在293T细胞中表达;与空载体组相比,细胞中过表达mGBP5可显著减少胞内新孢子虫的数量。结果表明,新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞会导致mGBP5表达上调,并靶向新孢子虫的纳虫泡膜,从而起到抑制新孢子虫增殖的作用。