CRISPR/Cas9技术编辑Wx基因创制新型糯稻种质

控制水稻胚乳直链淀粉合成的Wx基因是决定稻米蒸煮食味品质的主效基因。适当降低稻米的直链淀粉含量可显著提高稻米蒸煮食味品质。编辑Wx基因编码的GBSSI蛋白C末端非关键位点有望微调其酶活性和胚乳直链淀粉含量,进而改良稻米蒸煮食味品质。在未检测到关键结构域和位点的Wx基因3′端设计靶位点T1和T2(分别位于Wx基因第12和第13外显子),利用CRISPR/Cas9技术进行编辑。通过PCR和测序筛选获得纯合突变株系,用表观直链淀粉含量测定、凝胶渗透色谱、Western Blot和qRT-PCR等技术分析其对水稻胚乳直链淀粉合成和Wx基因表达的影响。共获得8种保留GBSSI主要结构域的纯合突变系C1~C8。其中,C2和C3中推测翻译的GBSSI蛋白仅有第518~550/551位密码子发生移码;C1、C4~C8中推测翻译的GBSSI蛋白分别从第551位和第517/518位密码子开始移码。C1~C8米粉中表观直链淀粉含量显著降低,从野生型的16.79%下降到3.69%~4.44%,但均稍高于含自然突变wx基因的糯稻近等基因系的2.92%。GPC结果显示,突变系中无直链淀粉合成,但其支链淀粉中长链(Ap2)的链长均长于糯稻近等基因系wx。qRT-PCR和Western Blot结果显示,C1~C8发育种子中Wx基因的转录水平无显著变化,但除C2和C3有一定量GBSSI蛋白表达外,其他纯合系中均无GBSSI蛋白表达。综上所述,本研究通过CRISPR/Cas9技术创建了淀粉精细结构略区别于常规糯稻的新型糯稻种质C1~C8,为水稻品质改良提供了新种质。同时也证明GBSSI蛋白C末端第518~551位氨基酸对其酶活性的形成有重要影响。这些结果为进一步解析GBSSI蛋白的结构以实现其精准编辑提供了参考。