牛传染性鼻气管炎病毒gC蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

为制备牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gC蛋白的特异性单克隆抗体,并分析其免疫学特性,以原核表达并纯化的重组gC蛋白为免疫原注射免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。建立间接ELISA方法筛选分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D6。3D6的亚类为IgG1型,轻链为κ链;上清、腹水抗体效价分别为6.4×103、1.28×105;Western blot和间接免疫荧光试验表明该单克隆抗体能识别牛gC蛋白。利用3D6细胞株分泌的单克隆抗体建立了检测IBRV的双抗体夹心ELISA方法,结果证明,该方法特异性和敏感性良好,为快速诊断IBRV和研究gC蛋白功能奠定了基础。

裂谷热病毒Gc蛋白主要抗原区的表达、纯化及鉴定

根据裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)M基因(Gen Bank登录号:DQ380206)序列,用PCR方法扩增其主要抗原区,将目的基因克隆至原核表达质粒p ColdⅠ中,将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,诱导表达重组蛋白,将表达蛋白利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化。纯化后的蛋白分别应用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定,结果显示,本研究不仅成功表达出Gc蛋白的主要抗原区,而且具有良好抗原性,为后续裂谷热抗原ELISA试剂盒的研制奠定了物质基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒Gn和Gc蛋白的分段表达

目的分段表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)Gn和Gc蛋白。方法采用PCR方法克隆了SFTSV Gn和Gc基因上三段相互重叠的基因片段Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3,将PCR产物分别连接到原核表达载体pET28a(+)上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),将其分别转化感受态菌BL21,IPTG诱导表达,通过Western blot鉴定Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3蛋白的表达。结果成功构建重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),Western blot可见Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2和Gc3编码蛋白的成功表达。结论 Gn和Gc蛋白的分段表达成功,为进一步深入研究SFTSV的Gn和Gc蛋白结构与功能及精确定位其抗原表位奠定了基础。

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×10^5～1∶2×10^6;3株单抗都具有间接免疫荧光试验（IFA）和免疫印迹试验（Western-blotting）反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。

新型伪狂犬病病毒gB、gC蛋白串联表达及免疫活性分析

为研究新型PRV毒株主要抗原表位,并获得具有良好免疫原性的表位串联体,本研究通过扩增新型PRV FJ-2012株gB、gC蛋白基因片段,经密码子优化后构建串联表达序列,并链接原核表达载体pET-28a(+)克隆位点,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达获得gBC串联蛋白,并用间接ELISA法测定其兔多克隆抗体血清效价,通过Western blot、间接免疫荧光试验评价其免疫活性。结果表明成功构建了PRV-gBC串联蛋白表达体系,并获得新型PRV FJ-2012株gBC串联重组蛋白;ELISA检测其克隆抗体血清效价可以达到1∶6400,Western blot试验显示gBC串联蛋白与多抗血清能产生特异性反应,免疫荧光试验说明克隆抗体血清能与FJ-2012株抗原发生免疫反应。本研究串联表达的新型PRV FJ-2012株gB、gC跨膜区域蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究新型PRV优势抗原表位奠定了基础。

Gc蛋白的分离纯化

本文报道Gc蛋白的分离与纯化.人血浆经DEAE-Sephadex-A50, Sephadex G100和DEAE-Sephadex-A50三次柱层析即可获得纯化Gc.纯化Gc经PAGE, SDS-PAGE和免疫电泳等证明,其纯度和特异性均符合要求.

用固相pH梯度等电聚焦分析Gc蛋白亚型

用固相ｐＨ梯度等电聚焦技术及免疫固定技术对２０１名北京地区无关汉族群体的人血清Ｇｃ蛋白亚型进行了分型鉴定及基因频率的调查．Ｇｃ￣（ｌＦ）为０．３６９８．Ｇｃ￣（ｌｓ）为０．２８１２．Ｇｃ￣２为０．３４９０．观察值与期望值吻合良好（Σｘ￣２＝１．０５７，Ｐ＞０．７０）

暴发性肝衰竭时血清Gc蛋白的变化及意义

血清Gc蛋白又称维生素D结合蛋白,是细胞外肌动蛋白清除系统的重要组成部分,主要合成于肝脏,半衰期较短,在血清中以天然蛋白、与25-羟-维生素D及肌动蛋白结合等形式存在(后者所占比例甚少)。当细胞损伤致细胞内肌动蛋白大量外释时,Gc迅速与之结合成更多的Gc:肌动蛋白复合物,并使Gc水平降低,它是反映肝细胞坏死和肝脏储备能力的可靠指标,对患者的预后判断具有重要的参考价值。

鸡传染性喉气管炎病毒gC蛋白的多抗制备、细胞定位及功能研究

为制备对鸡传染性喉气管炎具有诊断应用价值的抗体,并研究鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)gC蛋白在LMH细胞内的分布及gC蛋白对病毒在细胞间传播过程中的作用,本研究以ILTV—LJS09毒株基因组为模板,应用PCR方法扩增gC基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)构建pET-32a—gC质粒,经IPTG诱导表达并纯化,获得His—gC重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot结果表明,所制备的兔抗-ILTV gC抗体能与纯化的His—gC蛋白发生特异性反应且能检测到内源性gC蛋白。间接免疫荧光试验结果表明,所制备的兔抗ILTV-LJS09 gC蛋白的多抗能与ILTV LJS09、HLJ0507、MDJ0442、SD0203、Zhj1298毒株反应,特异性良好。采用获得的抗gC抗体观测LJS09-gC蛋白在LMH细胞内的分布,发现gC蛋白主要存在于病毒感染细胞的胞质和胞膜上,细胞核和未感染的细胞中没有gC蛋白。利用抗体中和ILTV gC蛋白的试验结果表明,gC蛋白可能直接参与病毒在细胞间传播,从而影响病毒蚀斑的形成。本研究成功制备了具有诊断价值的兔抗ILTV-LJS09 gC蛋白的多克隆抗体,并证实LJS09 gC蛋白在分布及功能上具有a-疱疹病毒的保守性,为gC蛋白生物学特性和ILTV感染机制的研究提供了重要数据。

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。

裂谷热病毒截短型Gc蛋白的真核表达与纯化

目的:对裂谷热病毒截短型Gc蛋白进行真核表达与纯化,并鉴定其免疫反应性。方法:在截短型Gc蛋白的基因5'和3'端分别添加tPA信号肽和StrepⅡ-tag,再将其克隆到真核表达载体pCAGGs中,转染Expi293F细胞进行真核表达;用StrepTrap亲和层析柱纯化,ELISA检测该蛋白与特异抗体的免疫反应性。结果:截短型Gc蛋白在Ex⁃pi293F细胞培养上清中获得表达,经纯化后得到的Gc蛋白浓度为0.7 mg/mL;该蛋白与针对Gc蛋白特异的单克隆抗体特异性结合。结论:截短型Gc蛋白的表达与纯化为裂谷热病毒疫苗和中和抗体研究奠定了良好的基础。

用快速高效液相色谱系统分离纯化Gc蛋白

报告Gc蛋白的一种分离方法，为免疫制备抗Gc血清制备抗原。硫酸该分级沉淀出含Gc的人血清组份，BlueSepharoseCL－6B亲和色谱除去含Gc硫酸铸分级沉淀的人血清组份中的白蛋白，快速高效液相色谱系统过Alkyl-SuperoseTMHR5／5疏水色谱柱和MonoQHR5／5离子交换柱。聚丙烯酸胺凝胶解离、非解离电泳证明，Gc蛋白得到了彻底纯化。免疫固定显示：纯化出的蛋白确实是Gc蛋白．为1-1型。快速高效液相色谱为蛋白质的纯化提供了新的技术及仪器手段。

尿液GC蛋白的表达水平与膀胱癌的相关性研究

选取2014年6月～2015年5月我院及合作医院泌尿外科收治的膀胱癌患者30例设为膀胱癌组及同期体检的健康人群30例设为健康组，收集两组患者的尿液标本。采用Western- blotting测定两组患者尿液标本中的GC蛋白表达水平。膀胱癌组各病理分期患者的GC蛋白表达水平与健康组比较差异均具有统计学意义（P〈0．05），且GC蛋白表达水平与膀胱癌临床分期呈正相关，各期之间比较差异均具有统计学意义（P〈0．05）。尿液中GC蛋白的表达水平与膀胱癌存在一定关系，且其表达水平与膀胱癌的分期有关。

转cry1Ab/Gc基因玉米的不同转化事件Bt蛋白表达和抗虫性分析

分析不同转化体Bt蛋白表达量和评估其抗虫性,进而筛选优异转化事件是转基因玉米新品种培育研究中的重要环节.为分析转cry1Ab/Gc基因玉米中Bt蛋白表达特性与抗虫性的关系,筛选优秀转化事件,研究以三个转化事件HG-1、HG-2、HG-3为试验材料,利用ELISA检测、玉米螟生测等技术,在室内和田间详细分析心叶期和抽丝期玉米抗虫蛋白表达量,并评估抗虫性.研究结果表明,同一转化事件不同组织或器官Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,均表现为叶>茎>根;不同时期叶片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,表现为抽丝期>心叶期;不同转化事件间,心叶期转化事件HG-1的叶片、抽丝期转化事件HG-1和HG-2的茎中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明显高于其他材料.室内和田间亚洲玉米螟生测试验结果表明:不同转化事件抗虫性差异显著,转化事件HG-1在心叶期和抽丝期亚洲玉米螟抗性显著高于其他两个玉米转化事件,与该时期Cry1Ab/Gc蛋白高表达的试验结果一致.本研究结果证实不同玉米转化事件Bt蛋白表达量显著差异,心叶期和抽丝期Bt蛋白表达量与亚洲玉米螟抗性呈正相关,可以作为抗虫转基因玉米优秀转化体初步筛选的重要技术指标,具有可操作性强、技术稳定性好、节省时间等优势,为抗虫转基因玉米新品种培育研发提供数据参考.

Gc、Pi蛋白亚型的快速微量电泳分析

用快速微量等电聚焦技术对１９０名北京地区汉族健康人血清Ｇｃ蛋白亚型、Ｐｉ蛋白亚型进行分型鉴定和基因频率调查．上样量为１．５μｌ，电泳和染色各０．５ｈ．Ｇｃ￣（１Ｆ）＝０．４８９１，Ｇｃ￣（１Ｓ）＝０．２４３２，Ｇｃ￣２＝０．２６７８．观察值与期望值吻合良好．（∑Ｘ￣２＝１．４０４，０．７＜Ｐ＜０．８）．Ｐｉ￣（Ｍ１）＝０．７５４２，Ｐｉ￣（Ｍ２）＝０．１８０８，Ｐｉ￣（Ｍ３）＝０．０６５０，观察值与期望值吻合也良好，（∑Ｘ￣＝１．１２３３，０．７＜Ｐ＜０．８）．

Gc球蛋白在不同方式治疗慢性重型肝炎中的检测意义

目的 ：探讨慢性重型乙型肝炎患者经内科治疗及肝移植前后Gc球蛋白的变化以及丙氨酸氨基转移酶（alanine transarninase,ALT）变化的相关性,初步阐明Gc球蛋白在重型乙肝患者中的检测价值。方法：选取兰州大学第一医院2004-2009年慢性重型乙型肝炎肝移植治疗患者14例,慢性重型乙型肝炎内科治疗患者20例,分别于治疗前、后各阶段留取血液标本,另取健康对照者20例。采用ELISA法检测肝功能及Gc球蛋白。结果：慢性重型乙型肝炎内科治疗组血清中Gc球蛋白含量治疗前、治疗后2、4、6、8周分别为（295.74±76.13）、（159.37±41.02）、（109.72±30.48）、（100.19±29.21）、（86.20±28.38）mg/dl,与正常对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）;慢性重型乙型肝炎肝移植组血清中Gc球蛋白含量术前、术后6、12、18、24个月分别为（4.19±1.17）、（30.89±23.04）、（88.30±52.87）、（200.07±108.32）、（324.17±119.14）mg/dl,与正常对照组相比,差异具有统计学意义（P〈0.05）;内科治疗组治疗后ALT呈下降趋势,与治疗前相比差异有统计学意义（P〈0.05）,肝移植组手术前后ALT变化不明显。结论：血清GC球蛋白的变化可以预测内科治疗和肝移植后的重型乙型肝炎患者病情演变,可为临床医师选择合理治疗方式提供参考。

肝病患者血清Gc球蛋白和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10检测及临床意义

目的分析Gc球蛋白在肝病患者,尤其是重症肝炎患者血中的浓度改变及临床意义;探讨肝病患者血清Gc球蛋白和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10的关系。方法应用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒体外检测不同类型肝病患者血清中游离Gc球蛋白和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10的浓度。结果重症肝炎组较急性、慢性肝炎组、肝硬化组及正常对照组相比,Gc球蛋白浓度下降得最为显著,且有统计学意义;Gc球蛋白和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10在各种肝病中具有相关性。结论 Gc球蛋白的浓度的改变和肝脏坏死程度关系密切,Gc球蛋白可以作为诊断重症肝炎的敏感指标;Gc球蛋白和上述4种细胞因子在不同的肝病类型中具有不同的相关性。

基于原核表达鸭瘟病毒gC蛋白建立的表面等离子共振检测技术的研究

本研究旨在应用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)建立鸭瘟血清的SPR检测方法。PCR扩增鸭瘟g C基因全长,亚克隆于原核表达载体pET32a中,诱导、表达、纯化鸭瘟g C蛋白,将其作为捕获蛋白偶联芯片,建立了鸭瘟的SPR检测方法。敏感性、特异性和实用性分析结果显示,该SPR方法仅与鸭瘟阳性血清有明显反应,而对鸭流感病毒、番鸭细小病毒、传染性喉气管炎病毒、小鹅瘟病毒、马立克病毒、鸭源沙门菌和鸭源大肠杆菌等血清为阴性反应;倍比稀释鸭瘟阳性血清,SPR的灵敏度可达0.1?g;对留存的19份疑似鸭瘟血清的SPR检测与商业化ELISA的检测结果完全一致。上述结果表明,本研究建立的表面等离子共振技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、样品免标记等特点,适用于鸭瘟血清的快速检测。

赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

鸭肠炎病毒gC糖蛋白胞外区优势抗原表位的筛选与鉴定

为筛选出鸭肠炎病毒(DEV)gC糖蛋白胞外区的优势抗原表位,本试验通过抗原表位作图法对DEV-gC基因进行分段克隆并构建重组表达载体,表达蛋白经纯化后进行Western blot分析。结果显示,经过4轮筛选,DEV-gC糖蛋白优势抗原表位为第73-88位氨基酸。该优势表位的发现为DEV-gC糖蛋白具体功能区的研究、诊断试剂及表位疫苗的研制奠定了物质基础。