利用CRISPR/CAS9技术构建QKI敲除GC1-spg细胞株及其生物学功能检测

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建QKI敲除的GC1-spg细胞株,并在体外研究QKI对GC1-spg细胞增殖和分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9系统的PX330质粒构建敲除QKI的重组质粒,转染GC1-spg野生型细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和基因测序鉴定出GC1-spg敲除QKI细胞株;常规培养野生型和敲除细胞株,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)绘制增殖曲线和荧光定量PCR(q-PCR)检测减数分裂相关基因变化。结果本研究成功构建出QKI敲除GC1-spg细胞株,与对照组相比,QKI敲除细胞株的增殖明显下降(P<0.05),减数分裂相关分子标志基因c-kit、Mtl5和Hspa2表达量明显降低(P<0.05)。结论 QKI蛋白可以影响GC1-spg的增殖和分化,因此QKI蛋白可能通过影响增殖和分化而影响精子发生。

RNA靶向的CRISPR/CasRx系统在小鼠精原细胞系GC1-spg中的应用

目的探究CRISPR/CasRx介导的RNA水平的基因敲降在小鼠精原细胞系GC1-spg的应用。方法利用同源重组的方法构建EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs表达质粒(CasRx-gRNA)和EF1a.EGFP、EF1a.mCherry、EF1a.tdToamto 3种荧光蛋白表达质粒。在人胚肾细胞系HEK-293T内瞬时转染3种荧光蛋白表达质粒和CasRx-gRNA表达质粒,通过荧光强度、Western blot检测外源基因(荧光蛋白、EGFP和mCherry)的敲降情况。在HEK-293T细胞内转染CasRx-gRNA,通过q-PCR检测内源基因mRNA和lncRNA干扰后的表达水平。在小鼠精原细胞系GC1内瞬时转染外源基因egfp、mCherry和CasRx-gRNA表达质粒并通过以上方法检测外源基因(荧光蛋白)沉默效率。结果成功构建了CasRx-gRNA和3种荧光蛋白表达质粒。在HEK-293T细胞内CRISPR/CasRx介导的RNA干扰外源基因(egfp、mCherry)和内源基因(mRNA、lncRNA)后,表达水平均显著下调(P<0.01)。在小鼠精原细胞系GC1内验证CRISPR/CasRx系统,可有效和特异敲降外源基因egfp、mCherry。结论CRISPR/CasRx系统能够在GC1-spg细胞中发挥有效和特异的敲降作用,为雄性生殖发育的研究提供新的基因沉默工具。

沉默SEMG1蛋白对精原细胞GC-1细胞周期及凋亡的影响

目的:探究沉默生精蛋白Ⅰ(SEMG1)对精原细胞系GC-1细胞周期及凋亡的影响。方法:利用脂质体转染法将SEMG1小干扰RNA(siRNA)转染精原细胞株GC-1,以空白组(空白对照组)和非特异性siRNA转染组(阴性对照组)作为对照;使用Western印迹法检测各组细胞SEMG1蛋白的表达水平,流式细胞术分析各组细胞的凋亡率及细胞周期。结果:与空白对照组和非特异性siRNA转染组相比,siRNA-SEMG1(si-SEMG1)转染组细胞的SEMG1蛋白表达水平(2.51±0.13,2.50±0.12 vs 1.80±0.05)明显降低(P<0.01);空白对照组、阴性对照组和siRNA-SEMG1转染组细胞的细胞周期无明显差异(P>0.05),但siRNA-SEMG1转染组细胞凋亡率达到(6.77±0.15)%,明显高于空白对照组(0.70±0.06)%和阴性对照组(0.8±0.06)%(P<0.01)。此外,Western印迹结果显示,siRNA-SEMG1转染组细胞的caspase-3蛋白表达水平显著上升(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论:siRNA-SEMG1能有效沉默精原细胞GC-1中SEMG1蛋白的表达,并最终促进GC1-细胞凋亡。