刺梨GDP-L–半乳糖磷酸酶基因的表达及其与AsA积累的关系

采用RT-PCR和RACE技术,从刺梨(Rosa roxburghii Tratt)果实中扩增出GDP-L–半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose pyrophosphatase,GGP)基因的全长cDNA序列,并分析其在不同组织和果实不同发育阶段的表达特点及其与AsA积累的关系。结果表明:刺梨GGP基因cDNA(RrGGP,GenBank登录号:HM998753)包含1个长度为1 341 bp的开放阅读框(ORF),编码445个氨基酸;其氨基酸序列与苹果、猕猴桃等的相似性均在80%以上。RT-PCR分析表明,该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显:在果实中的表达量最强,叶中次之,而花和茎中只能检测到极微弱的表达。在果实不同发育时期都能检测到RrGGP的表达,在发育初期(花后50 d内)表达较弱,花后60~100 d呈高水平表达,而后随着果实成熟而下调。刺梨中RrGGP的表达特点与AsA积累高度一致,意味着该基因可能是果实发育过程中AsA合成的关键基因。

软枣猕猴桃GDP-L-半乳糖磷酸酶电子克隆与生物信息学分析

目的:通过电子克隆技术对软枣猕猴桃GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)基因进行预测。方法:以猕猴桃GGP序列为探针,基于NCBI中软枣猕猴桃的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接,利用生物信息学数据库及相关软件对其结构和功能进行预测分析。结果:软枣猕猴桃GGP基因全长1866 bp,包含1353 bp的开放阅读框,编码450个氨基酸。结论:本研究为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。

苹果L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶cDNA克隆及其表达

【目的】了解苹果果实L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP)基因的特性,探索苹果GPP基因表达特性及其与抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平的关系。【方法】通过RT-PCR从苹果果实中克隆GPP全长cDNA,分析其序列特征,进行原核表达,制备GPP特异抗体,分析GPP mRNA及其蛋白表达水平与苹果不同组织AsA的关系。【结果】从‘嘎啦’苹果果实中克隆的GPP cDNA(GenBank登录号为FJ752240)包含的最大开放阅读框(open reading frame,ORF)为813 bp,编码270个氨基酸残基,预测分子量为29 kD,该基因与其它植物报道的GPP基因具有较高的相似性,但与肌醇-1-磷酸磷酸酶基因差异较大。构建的pET-32a(+)-GPP载体在大肠杆菌BL21(E.coli BL21)中异源表达后,获得主要以包涵体存在约50 kD的融合蛋白GPP-His(His约21 kD)。以该蛋白制备抗体,与重组蛋白的Western杂交表明该抗体能与GPP发生特异反应。对苹果可溶性蛋白杂交显示,苹果体内GPP蛋白约33 kD。在苹果不同组织中,GPP mRNA与蛋白质的相对表达水平与AsA含量存在明显的一致性。【结论】以单体形式存在的苹果GPP蛋白具有翻译后修饰特性,且该基因的表达在苹果AsA合成调控中可能起重要作用。

枣L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶cDNA克隆及生物信息学分析

枣果是抗坏血酸含量最高的果实之一,而L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP)基因是抗坏血酸合成中的一个重要基因,至今未见该基因在枣中的相关报道。本研究根据GenBank中登录的苹果、桃和拟南芥等植物GPP保守序列设计引物,采用RT-PCR法,从‘金丝小枣’(Ziziphus jujuba‘Jinsixiaozao’)叶片中克隆出该基因并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。该基因包含完整的开放阅读框为813bp,编码270个氨基酸残基,预测分子量为29.083kDa,理论pI值为5.28,命名为ZjGPP(登录号KJ739593);进一步的生物信息学分析表明,该序列具有典型的肌醇单磷酸化酶结合区域,属于FIG家族蛋白;其氨基酸与其他植物GPP基因具有较高的同源性。进化树分析表明,该基因与桃、苹果和刺梨等蔷薇科植物的GPP亲缘关系较近。

蛋白磷酸酶1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中的表达

目的观察D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的定位表达及作用。方法 40只昆明小鼠随机分为对照组和D-半乳糖组,每组20只。D-半乳糖组颈背部皮下注射D-半乳糖(800mg·kg^(-1)·d^(-1)),对照组每日皮下注射等量生理盐水,连续给药8w;停药后检测血浆总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;免疫荧光法定位PP1在耳蜗的表达,real-time PCR法检测耳蜗中PP1mRNA水平,Western blot法检测小鼠蛋白磷酸酶1核目标亚基(protein phosphates 1nuclear targeting subunit,PNUTS)、PP1及caspase-3的表达。结果与对照组比较,D-半乳糖组小鼠总SOD活力降低而MDA水平升高(均为P<0.01);PP1主要定位表达于小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹细胞的胞核和胞浆中,且给予D-半乳糖后,小鼠耳蜗中PP1mRNA及其蛋白表达水平显著升高,而PNUTS表达减少,caspase-3表达增加(均为P<0.05)。结论 PP1在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节及血管纹细胞中表达,且参与了其耳蜗老化过程。

西伯利亚白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆与序列分析

目的克隆西伯利亚白刺Nitraria sibirica维生素C合成过程中L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP)编码基因。方法利用生物信息学方法对西伯利亚白刺三代转录组数据进行分析,共鉴定出2个GPP基因,并从西伯利亚白刺中成功克隆得到2条NsGPP基因序列,进一步利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构、保守序列以及系统进化等进行分析,并结合RNA-seq数据分析其在盐胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR实验检测其在不同组织中的表达水平。结果从西伯利亚白刺中成功鉴定克隆出2个NsGPP基因,2个NsGPP基因所编码蛋白均含有保守的FBPase/IMPase/glpX-like(FIG)结构域,且与其他植物GPP蛋白具有较高的相似性。利用多个物种的GPP蛋白序列构建系统进化树,结果显示西伯利亚白刺与灌木或半木质化草本植物亲缘关系更近。Motif分析发现NsGPP蛋白与拟南芥等GPP蛋白较为相似,但也存在差异,并且2个NsGPP蛋白之间也存在差异。此外,NsGPP1与NsGPP2的蛋白三维结构之间也存在微小差别。RNA-seq分析表明,不同浓度NaCl处理下,NsGPP1的表达逐步升高的趋势,而NsGPP2的表达量则较低,且在盐胁迫后其表达水平逐渐降低。qRT-PCR实验结果显示,白刺GPP基因的表达存在组织表达特异性,且在同一组织中NsGPP1的表达水平显著高于NsGPP2。结论从西伯利亚白刺中成功克隆到2个NsGPP基因,其编码蛋白均含有保守的FIG结构域,且与拟南芥等草本植物的GPP蛋白更为相似。NsGPP基因在不同组织中表达水平具有显著差异,其中NsGPP1可能参与西伯利亚白刺维生素C生物合成并参与白刺抵抗盐胁迫。为进一步解析白刺维生素C生物合成以及耐盐分子机制提供了理论依据。

D-半乳糖致衰老小鼠血清钙、磷及骨密度等指标的变化

目的 研究 D-半乳糖致衰老过程生成的晚期糖化终末产物 (AGEs)对老年骨质疏松症的影响。方法 用 D-半乳糖注射 BAL B/ C断乳雄性小鼠 4个月 ,建立衰老模型 ,同时模拟体内环境体外培养 AGEs,以证实 AGEs的存在 ,并对青年组、模型组和自然衰老组进行血清钙、磷、碱性磷酸酶及骨密度等指标的检测与比较。结果 模型组血清钙、血清碱性磷酸酶、骨密度和股骨指数均与青年组有显著差异 (P<0 .0 1 ) ,与自然衰老组的变化趋势一致 ,并且比自然衰老组改变更为明显。结论 长期大量注射 D-半乳糖致衰老的同时可能导致骨质疏松症。

中药“863”对大鼠D-氨基半乳糖肝损伤的防护作用

用组织比学,电镜细胞化学,生物化学和腹腔巨噬细胞(PM)吞噬功能测定等方法观察了中药“863”对 D—氨基半乳糖(D—Ga1N)诱发大鼠肝损伤的防护作用。结果表明:D—Ga1N 使肝脏某些酶活性降低,肝糖元、SH 减少,超氧化物歧化酶(SOD)含量下降。Ca^(++)含量升高.“863”能促使肝脏某些酶的活性增强,使肝搪元、SH、SOD、Ca^(++)的含量及 PM 的吞噬功能得以恢复.

PNUTS在D-半乳糖诱导老化小鼠耳蜗中的表达

目的观察D-半乳糖诱导的老化小鼠耳蜗中蛋白磷酸酶1核目标亚基(PNUTS)的表达。方法 6周龄清洁级昆明小鼠20只随机分为对照组和D-半乳糖组,每组10只。D-半乳糖组小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖800 mg/(kg·d);对照组颈背部注射等量生理盐水,均为每日1次,连续8周。造模完成后,进行听脑干反应(ABR)测试检测小鼠听力变化;取2组小鼠耳蜗,采用Western blot检测PNUTS及p53蛋白表达;免疫组织化学观察PNUTS蛋白在耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹中的表达与分布情况。结果 D-半乳糖组小鼠在8、12、24 k Hz这3个频率下的ABR阈值与对照组差异均无统计学意义。PNUTS蛋白在小鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞及血管纹细胞中有表达,且D-半乳糖组小鼠耳蜗中PNUTS蛋白的阳性表达水平较对照组显著降低(P<0.05);而p53蛋白表达水平则显著升高(P<0.01)。结论 PNUTS在小鼠耳蜗中有表达,且D-半乳糖能够诱导老化小鼠耳蜗中PNUTS表达下调。

血清半乳糖凝集素-9、碱性磷酸酶、基质金属蛋白酶-9水平对冠状动脉性心脏病患者冠脉易损斑块的诊断价值

目的评价血清半乳糖凝集素-9(galectin-9)、碱性磷酸酶(ALP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平对冠状动脉性心脏病(CHD)患者冠状动脉易损斑块的诊断价值。方法回顾性分析2018年10月至2020年10月收治的128例CHD患者。根据CT冠脉造影分为稳定型心绞痛组(SAP组)60例和急性冠脉综合征组(ACS组)68例。根据斑块性质分为稳定斑块组60例、易损斑块组38例和混合斑块组30例,同时选取于同期进行体检的50名健康志愿者作为健康对照组。检测血清galectin-9、ALP、MMP-9水平。绘制CHD患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平预测冠状动脉易损斑块的受试者操作特征曲线(ROC)曲线。分析CHD患者血清galectin-9水平与ALP、MMP-9水平的相关性。结果ACS组患者易损斑块比例高于SAP组患者,而稳定斑块比例低于SAP组患者,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。ACS组、SAP组患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平均高于健康对照组,ACS组患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平均高于SAP组患者,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。易损斑块组、混合斑块组及稳定斑块组患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平均高于健康对照组,易损斑块组患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平均高于混合斑块组及稳定斑块组患者,混合斑块组患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平均高于稳定斑块组患者,且差异均有统计学意义(P均<0.05)。ROC曲线显示,CHD患者血清galectin-9、ALP、MMP-9水平联合预测冠状动脉易损斑块的敏感度、特异度及曲线下面积(AUC)均高于单独检测(P均<0.05);Spearman相关分析显示,CHD患者血清galectin-9水平与ALP、MMP-9水平呈正相关(r=0.381、0.377,P<0.001)。结论血清galectin-9、ALP、MMP-9水平对CHD患者冠状动脉易损斑块预测价值较高,有助于临床制定针对性治疗方案。

何首乌的抗衰老作用研究

目的探讨何首乌对抗D -半乳糖所致亚急性衰老的机制。方法将小鼠 30只随机分为 3组 :对照组、衰老模型组和何首乌治疗组。衰老模型组、何首乌治疗组用D 半乳糖皮下注射 ,1次 /d ,连续 6周造成小鼠衰老。第 3周时 ,何首乌治疗组给小鼠灌胃何首乌。第 6周末处死。测定不同组织脂褐质 (lipofuscin ,LPF)、Na+ /K+ ATP酶 (Na+ /K+ ATPase)、超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase ,SOD)和丙二醛含量。结果何首乌可降低小鼠脑组织和肾组织的LPF含量 ,升高心肌Na+ /K+ ATPase活性和肝脏SOD活性。结论何首乌具有抗衰老作用 。

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。

肝胆疾病血清酶谱与总胆汁酸检测的意义

目的：探讨血清肝酶谱与总胆汁酸联合检测对常见肝胆疾病的诊断价值。方法：用日立7170S生化分析仪对425例肝胆患者血清进行检测分析。结果：各种肝胆疾病中血清酶(ALT、AST、ALP、GGT)与总肝胆汁酸(TBA)均有不同程度的升高与变化。结论：TBA测定是肝胆疾病的一个敏感指标。对肝胆疾患的患者同时检测血清酶ALT、AST、ALP、GGT和TBA，有利于临床诊断与治疗。

报告基因系统的研究进展

综述氯霉素转乙酰酶 (CAT)、β 半乳糖苷酶 (β gal)、β 葡萄糖苷酸酶 (p GUS)、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP)、荧光素酶(luc)、绿荧光蛋白 (GFP)等报告基因系统研究与应用进展 ;简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。

WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基甲基化的关系研究

目的构建WI-38细胞连续培养衰老模型,并探讨WI-38细胞衰老与蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)去甲基化水平的关系。方法连续培养WI-38细胞株直至细胞衰老而停止增殖,以群体倍增次数(population doubling level,PDL)记录细胞代龄并收集年轻细胞和衰老细胞,利用刃天青还原率检测细胞增殖活性,细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老率,Western blotting检测细胞内去甲基化PP2Ac的表达水平。结果 WI-38细胞连续培养至第43代时细胞停止增殖;衰老组细胞(43PDL)增殖活性明显低于年轻组(23PDL),差异具有统计学意义(P<0.01);衰老组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率明显高于年轻组,达93%,是年轻组的4.5倍;衰老组细胞去甲基化PP2Ac蛋白表达水平明显上升,是年轻组的3.3倍。结论 WI-38细胞复制性衰老与细胞内蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2Ac)的去甲基化表达水平相关。

强骨健脾汤对老年性骨质疏松症大鼠骨密度、骨微结构的影响及其机制

目的研究强骨健脾汤对D-半乳糖诱导老年性骨质疏松症大鼠骨密度的影响及其机制。方法将40只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、强骨健脾汤组和骨化三醇组,每组10只。除空白组大鼠外,其余组大鼠均在颈背部皮下注射D-半乳糖8周诱导老年性骨质疏松症。自造模开始,强骨健脾汤组给予强骨健脾汤颗粒冲剂3.125 g/(kg·d)灌胃,骨化三醇组给予骨化三醇混悬液0.05μg/(kg·d)灌胃,空白组和模型组灌胃等量生理盐水,均每日1次,持续8周。实验结束后,称量各组大鼠体重,测量胫骨、股骨、腰椎的骨密度;采集大鼠血清,检测钙、磷、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平;对左侧胫骨近端、股骨远端和L_(3~5)段腰椎进行micro-CT扫描,记录相关骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁连接密度(Conn.D)。结果与空白组比较,模型组大鼠体重、各部位骨密度、血钙水平、血磷水平、血BGP水平、血TRACP水平、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明显降低(P均<0.05),Tb.Sp明显增加(P<0.05);与模型组比较,强骨健脾汤组体重、各部位骨密度、血钙水平、血磷水平、血BGP水平、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明显增高(P均<0.05),血TRACP水平和Tb.Sp均明显降低(P均<0.05)。micro-CT二维扫描显示,模型组大鼠骨小梁稀疏,排列不规则;强骨健脾汤组和骨化三醇组大鼠骨小梁结构较密实。结论强骨健脾汤能增加老年性骨质疏松症大鼠骨密度,改善骨微结构,其作用机制可能与促进肠道对钙、磷的吸收,上调BGP水平和下调TRACP表达有关。