L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶的克隆表达及酶学性质研究

核苷酸糖鸟嘌呤5’-二磷酸-β-L-岩藻糖(5′-diphospho-β-L-fucose, GDP-L-岩藻糖)是岩藻糖基化寡糖植物和细菌生物合成途径的关键中间体。从脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的基因组DNA中克隆得到L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(fucose pyrophosphorylase, FKP)基因,并与载体pET-22b (+)连接,在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达。利用载体上组氨酸标签对重组酶分离纯化,并进行酶学性质分析。结果表明:FKP的最适温度和最适pH分别为45℃和7.5,该酶在pH 7.5~9.5之间很稳定,在4和12℃下孵育3 h,酶的初始活性保持在90%以上。最适反应条件下,重组FKP对底物岩藻糖的Km和Kcat分别为0.44 mmol/L、(31.49±2.5) s^-1。45℃下,在底物L-岩藻糖摩尔浓度为10 mmol/L条件下反应11 h后,最终产生的GDP-L-岩藻糖为2.1 mmol/L。

高山被孢霉GDP-L-岩藻糖合成途径中GDP-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

GDP-L-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成GDP-L-岩藻糖的真菌。GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化GDP-D-甘露糖合成GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明GDP-L-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现GDP-L-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内GDP-L-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产GDP-L-岩藻糖和酶法转化生产GDP-L-岩藻糖奠定了理论基础。

基于糖酵解相关基因GFUS对三阴性乳腺癌疗效预测模型构建与验证

目的基于生物信息数据库信息探讨糖酵解相关基因GDP-L-岩藻糖合酶(GFUS)对三阴性乳腺癌(TNBC)预后情况的预测价值。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库获取TNBC基因表达信息,应用生物信息学方法分析GFUS在TNBC中的差异表达及预后差异,筛选与GFUS共表达基因建立预测TNBC预后模型并验证。结果从TCGA数据库下载160例TNBC组织和113例正常组织的基因转录组数据,验证了GFUS在TNBC中的高表达与不良预后相关。基于GFUS共表达基因,通过COX回归分析得到3个与TNBC预后相关基因,以此构建模型。根据预后模型将外部数据集训练样本分为高风险组(45例)和低风险组(62例)。Kaplan-Meier生存分析显示,高风险组总生存情况低于低风险组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于糖酵解相关基因GFUS建立的模型可有效预测TNBC预后情况,并为个体化治疗提供新思路。