ALKBH5调控GEFT的m6A修饰对胆管癌转移及EMT的实验研究

目的探究alkB同源蛋白5(ALKBH5)调控鸟嘌呤核苷酸交换因子T(guanine nucleotide exchange factors T,GEFT)的m6A修饰对胆管癌转移和上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法将HuCCT1细胞按照转染类别分为Control组,NC-sh组、ALKBH5-sh组、NC-LV组、ALKBH5-LV组、ALKBH5-LV+NC-sh组和ALKBH5-LV+GEFT-sh组。Control组细胞不进行转染,使用Lipofectamine 2000对其他组细胞分别转染相应的慢病毒。采用MTT法检测细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭水平。采用RT-qPCR分析HuCCT1细胞中的ALKBH5,GEFT,Bax,Bcl-2,MMP2,MMP9,E-cadherin,N-cadherin和Vimentin的mRNA水平。采用Western blot分析HuCCT1细胞中的ALKBH5和GEFT蛋白水平。采用MeRIP-qPCR分析HuCCT1细胞中GEFT m6A甲基化水平。结果与Control组和NC-sh组比较,ALKBH5-sh组ALKBH5和GEFT的mRNA和蛋白水平降低,相对细胞活力降低,细胞凋亡率和Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低,迁移和侵袭细胞数量降低,MMP2和MMP9 mRNA水平降低,E-cadherin mRNA水平升高,N-cadherin和Vimentin水平降低,GEFT m6A甲基化水平升高,差异具有统计学意义(F=43.347~1995.868,均P<0.001)。与Control组和NC-LV组比较,ALKBH5-LV组ALKBH5和GEFT的mRNA和蛋白水平升高,相对细胞活力升高,细胞凋亡率和Bax mRNA水平降低,Bcl-2 mRNA水平升高,迁移和侵袭细胞数量升高,MMP2和MMP9 mRNA水平升高,E-cadherin mRNA水平降低,N-cadherin和Vimentin水平升高,GEFT m6A甲基化水平降低,差异具有统计学意义(F=42.421~720.275,均P<0.001)。与ALKBH5-LV+NC-sh组比较,ALKBH5-LV+GEFT-sh组GEFT的mRNA和蛋白水平降低,相对细胞活力降低,细胞凋亡率和Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低,迁移和侵袭细胞数量降低,MMP2和MMP9 mRNA水平降低,E-cadherinmRNA水平升高,N-cadherin和Vimentin水平降低,差异具有统计学意义(t=7.175~77.872,均P<0.001)。结论ALKBH5和GEFT均促进胆管癌细胞的生长和转移,ALKBH5可能通过调控GEFT m6A甲基化修饰来影响胆管癌的转移及EMT。