构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体及其转染对星形胶质细胞增殖的影响

目的:构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体并进行鉴定,研究其转染星形胶质细胞后对细胞生长增殖的影响。方法:对实验室原有的pGFAP-IRES2-EGFP-p27质粒进行转化、扩增、抽提、酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序;通过设计引物,进行PCR扩增后分别获取GFAP启动子和p27基因片段,依次交换入线性化表达载体GV269和p DC315-GFAP-EGFP载体,最终构建pDC315-GFAP-p27-EGFP;将其转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测;转染星形胶质细胞后观察细胞生长和荧光表达情况;检测转染后星形胶质细胞细胞周期和凋亡比例、p27的表达情况。结果:经酶切鉴定和测序,成功鉴定真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27;经PCR鉴定和测序,成功构建重组腺病毒过表达载体pDC315-GFAP-p27-EGFP;经包装后,Ad-GFAP-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应,而且能够特异性地在星形胶质细胞中表达绿色荧光蛋白;经流式细胞仪分析,转染星形胶质细胞72 h后,与对照组相比,转染组处于S期的细胞比例下降,G1和G2期的细胞比例增高,凋亡比例增高(P<0.05);转染后第5天,星形胶质细胞中p27蛋白表达水平较对照组有明显升高(P<0.05)。结论:利用腺病毒包装系统AdMax成功构建了携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒过表达载体,其可以特异性转染星形胶质细胞过表达p27,对星形胶质细胞的生长增殖有明显抑制作用。

携带GFAP启动子的慢病毒载体介导外源基因在肝星状细胞的特异表达（英文）

目的旨在构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,检测体内外靶向肝星状细胞的外源基因表达的特异性和效率。方法通过报告基因实验筛选介导效率较高的GFAP启动子,以CMV启动子作为阳性对照分别介导荧光素酶在小鼠肝星状细胞(JS1)、人肝星状细胞(LX-2)及人肝细胞(L-02)中的表达。通过尾静脉注射将包装的慢病毒注射到四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠体内,通过活体成像和Western blot检测慢病毒颗粒在小鼠体内的分布,并通过免疫双荧光染色检测肝星状细胞的特异表达。结果人GFAP启动子比小鼠GFAP启动子驱动基因表达的效率高,而且在LX-2和JS1细胞中,人GFAP启动子介导的荧光素酶的活性及表达显著高于L-02细胞。活体成像显示小鼠腹部有荧光素酶的表达。GFAP启动子介导的荧光素酶可以与肝星状细胞的特异性生物标记蛋白GFAP、Desmin和α-Sma共定位。结论成功构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,在体外细胞系以及小鼠体内肝中均可以实现荧光素酶在肝星状细胞中特异性表达。

hTERT和GFAP双启动子条件复制腺病毒介导放射性碘治疗脑胶质瘤的实验研究

目的利用条件复制腺病毒Ad—Tp—E1a—Gp—NIS感染脑胶质瘤细胞，探讨其介导靶向性放射性碘治疗脑胶质瘤的可行性。方法克隆人端粒反转录酶（hTERT）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子，荧光素酶分析法检测启动子启动效率。构建并纯化条件复制腺病毒Ad—Tp—E1a—Gp—NIS，进行肿瘤选择性病毒复制实验。U87和U251细胞感染Ad—Tp—E1a—Gp—NIS后，进行Westernblot分析蛋白质表达，131I内流及外流和131I克隆形成实验。结果荧光素分析实验证明，hTERT和GFAP启动子分别可以引导荧光素蛋白在U251和U87细胞中表达，表达效率为37．31％～49．00％（F=5．87，P〈0．05）和59．75％～62．10％（F=11．89，P〈0．01）。Ad—Tp—E1a—Gp—NIS能够在hTERT阳性和GFAP阳性实现肿瘤选择性复制，且在GFAP启动子引导下能成功表达hNIS基因。Westernblot分析表明，hTERT蛋白和GFAP蛋白在U87和U251细胞中显示出相对分子质量为120×103和49×103的条带。感染Ad-Tp—E1a—Gp—NIS后，U87细胞摄碘能力提高78．80倍（F=2914．58，P〈0．01），U251细胞摄碘能力提高92．48倍（F=2275．91，P〈0．01）。体外细胞克隆分析证明，感染病毒并在131I中孵育12h后，超过90％的肿瘤细胞被杀死，而对照组细胞仅有65％（t=11．73～78．33，P〈0．01）。结论Ad·Tp·E1a-Gp-NIS能实现条件性复制并具有明确的肿瘤靶向性。在细胞水平实验中，能引导放射性131I杀死胶质瘤细胞。