DAS-ELISA和PAS-ELISA检测GFLV的技术研究

以中国农科院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材 ,对葡萄扇叶病毒(GFLV)进行了酶联免疫吸附测定 (ELISA)的检测技术研究。从操作步骤、灵敏度、检测时期以及检测部位等对双抗体夹心酶联免疫吸附测定法 (DAS -ELISA)和A蛋白夹心酶联免疫吸附测定法 (PAS -ELISA) 2种不同的检测方法进行了比较试验。发现 ,虽然DAS -ELISA在操作上较PAS -ELISA更为简便 ,但就结果而言 ,PAS -ELISA比DAS -ELISA的OD值高 ,更易进行结果的判断 ;且在病毒含量相对较低的情况下 ,PAS -ELISA显示出了较高的灵敏度。

PAS-ELISA检测GFLV和GLRaV-3技术的研究

以中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材,对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶相关病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)的检测技术的研究.从阴、阳性对照及抗血清或抗体浓度的选择,到不同时期、检测部位对结果的影响,建立了一套完整的ELISA检测GFLV和GLRaV-3程序;通过实验分析,该方法快速,简便,经济且灵敏度高,不失为葡萄病毒检测的一种新方法.通过检测,还了解到了GFLV的发病高峰在春季,主要发病部位在上部叶片,而GLRaV-3的发病高峰在秋季,重要发病部位在下部叶片.为葡萄病毒的综合防治打下良好的基础.

PAS-ELISA检测GFLV和GLRaV-3技术的研究

以中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材,对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)的检测技术的研究。从阴、阳性对照及抗血清或抗体浓度的选择,到不同时期、检测部位对结果的影响,建立了一套完整的ELISA检测GFLV和GLRaV-3程序;通过试验分析,该方法快速,简便,经济且灵敏度高,不失为葡萄病毒检测的一种新方法。通过检测,还了解到GFLV的发病高峰在春季,主要发病部位在上部叶片,而GLRaV-3的发病高峰在秋季,重要发病部位在下部叶片。

葡萄叶片植株再生及GFLV-CP基因的转化

利用无核白和黑王等12个品种的无病毒葡萄试管苗叶片为外植体,在NN69培养基(N itsch and N itsch 1969)试验了不同浓度的IBA和BA对其植株再生的影响。其中无核白、黑王、红地球和红宝石4个品种获得了稳定高频率的再生植株。以GUS基因为报告基因,通过根癌农杆菌介导,建立了葡萄离体叶片外源基因的遗传转化体系,而后将葡萄扇叶病毒外壳蛋白(GFLV-CP)基因转入葡萄叶片,通过卡那霉素筛选和PCR检测证明获得了转葡萄扇叶病毒外壳蛋白(GFLV-CP)基因的无核白葡萄植株。

三种ELISA方法检测葡萄卷叶病毒(GLRaV)和扇叶病毒(GFLV)的比较

检测是认识一种病害最基本的前提,通过对三种ELISA检测GLRaV和GFLV的比较认为,双抗夹心-ELISA(DAS-ELISA)、间接-ELISA(PTA-ELISA)和A蛋白夹心-ELISA(PAS-ELISA) 都能检测GLRaV和GFLV。DAS-ELISA能缩短检测的时间,然而这项技术具有较高的株系特异性,在检测中可能产生假阴性反应,因此,必要时可用PTA-ELISA和PAS-ELISA对一些关键样品进行复检。

我国葡萄扇叶衰退病相关病毒研究进展

葡萄扇叶衰退病(grapevine fanleaf degeneration disease,GFDD)是葡萄栽培中常见的病毒病害,在我国葡萄产区发生普遍,危害严重。引起该病的病毒种类有10余种,症状表现受葡萄品种、病毒种类、栽培条件等多种因素影响。由于高通量测序技术的发展与应用,我国鉴定发现了除葡萄扇叶病毒(grapevine fanleaf virus,GFLV)之外的3种GFDD相关病毒,即葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)、灰比诺葡萄病毒(grapevine Pinot gris virus,GPGV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)。系统综述了我国GFDD的主要病原及其侵染状况,可为该病害的精准防控提供参考。

葡萄病毒病多重RT-PCR检测技术体系优化分析

在确立葡萄卷叶病毒Ⅲ和扇叶病毒RT-PCR优化体系基础上,研究了多重PCR的主要成分:dNTPS、TaqDNA聚合酶、MgCl2对PCR反应的影响,从而确立了GLRaVⅢ、GFLV的多重RT-PCR检测体系。研究结果表明,多重PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的用量较单重PCR反应体系要低,而且可降低成本和缩短检测时间。

长臂光敏生物素标记葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因cDNA探针的制备及其在检测上的应用

由葡萄扇叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ，ＧＦＬＶ）导致的葡萄扇叶病在世界各地葡萄园内均有发生，是最为普遍和严重的病毒病害之一，感病葡萄可减产２０％～８０％。近年来，许多国家开展了葡萄脱毒苗木的培育和推广工作，同时进行了葡萄扇叶病毒...

葡萄扇叶病毒移动蛋白在寄主体内的动态检测和免疫金标记

利用葡萄扇叶病毒法国分离物F1 3 (Grapenivefanleafvirus,GFLV F1 3 )移动蛋白抗体对杭州分离物 (GFLV H)移动蛋白进行Westernblot,分析表明移动蛋白在接种GFLV H 3d后的苋色藜 (Chenopodiumamaranticolor)系统叶中就可检测到 ,随着时间推移 ,其积累量逐渐升高 ,接种 1 6d后达到最高值。接种 3 2d后的病叶已经枯黄 ,但移动蛋白积累量并没有减少。超薄切片电镜观察发现 ,在感染GFLV H的昆诺藜 (C .quinoa)和苋色藜的叶肉组织薄壁细胞中 ,病毒粒子呈纵列整齐地排列在小管状结构中 ,在胞间连丝中也发现有管状结构。免疫金标记显示胶体金能定位在细胞质、细胞壁和胞间连丝上 ,在管状结构也发现有少量的金粒子。

葡萄微茎尖培养及葡萄扇叶病毒的ELISA和探针检测

在建立‘藤稔’等５个葡萄品种离体培养快速繁殖体系的基础上，通过热处理和微茎尖脱毒培养获得了再生植株；并经过ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ和长臂光敏生物素标记ＧＦＬＶ－ＣＰ基因ｃＤＮＡ探针检测．结果表明白天３８℃夜晚３５℃处理脱除ＧＦＬＶ效果最佳；多次继代培养也有脱除ＧＦＬＶ的作用．从而首次获得了‘藤稔’、‘红地球’、‘９３０７’３个葡萄品种的脱除ＧＦＬＶ的试管苗．ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ与探针平行检测的结果还表明。

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。

葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的田间病状鉴别与防治

扇叶病毒和卷叶病毒是我国葡萄生产中的主要病毒种类,一些新发展地区由于对病毒的危害认识不够,盲目引种,已造成了酿酒企业和果农的严重经济损失。本文介绍了两种病毒的田间病状、与其易混淆的病害现象和传播途径,并提出了防治方法。

葡萄扇叶病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)RNA2序列设计4对特异性引物,通过引物筛选、体系优化,建立了以FL-HP1-F/R为引物的GFLV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998,灵敏性分别是常规RT-PCR和巢式RT-PCR的100倍和10倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小于2.59%,显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄EF1和GAPDH基因具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定12个葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,最高含量是最低含量的81 245.5倍,与ELISA和巢式RT-PCR相比,实时荧光定量方法能检测出更多的GFLV分离物。