绿色荧光蛋白(GFP)标记杧果细菌性角斑病病原菌及其定殖规律

为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定,成功获得带绿色荧光蛋白(GFP)标记的转化子Xcm003-EGFP,采用室内刺伤和盆栽苗灌根接种试验,结合组织学观察法,追踪该病原菌在不同杧果器官组织中的定殖规律。结果表明,病原菌通过伤口侵入杧果果实果皮外层细胞层,随着侵染时间推移,向内层果皮细胞层垂直扩散并定殖,后期病原菌在伤口处大量聚集,出现隆起开裂状病斑。在杧果叶片中,病原菌从伤口侵入叶片上表皮细胞层,随后迁移到叶肉细胞间隙,侵染后期,病原菌在气孔和伤口定殖,造成气孔和伤口堵塞,导致接种点出现黑褐色水浸病斑。盆栽苗灌根后发现,该病原菌可在土壤中定殖,入侵杧果根部,但并不扩散至其他杧果组织,不会为害整株幼苗。说明杧果细菌性角斑病病菌可在不同杧果组织中定殖,但仅表现为局部侵染特性。

生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性

将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖.

带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建

利用 DNA重组技术 ,将经定点突变改造的绿色荧光蛋白基因 ( gfp)克隆到植物表达载体p BI-1 2 1中 ,成功地构建了植物重组表达质粒 p BI-GFP.

长双歧杆菌NCC2705高效转化系统的建立及GFP表达

目的:建立长双歧杆菌NCC2705高效稳定的电转化系统,并以其为宿主表达绿色荧光蛋白(GFP),构建一个稳定的带报告基因的表达载体。方法:从双歧杆菌克隆载体pDG7中切取其在双歧杆菌中复制所必需的pMB1复制子插入质粒pUC19的多克隆位点区,并将gfp基因在双歧杆菌中进行表达;设计双歧杆菌电击转化体系,研究在不同电击电压条件下的电转效率。结果:首先构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒pUB1和带有gfp基因的表达质粒pUB2,用电击法将之转化至双歧杆菌,当细菌生长到D600nm约为0.5时制备感受态细胞,在电容25μF、电阻200Ω、电压12.5 kV/cm的电击条件下进行完整质粒转化,可得到较高的转化率。结论:构建了以长双歧杆菌NCC2705为宿主的高效稳定的表达系统,为进一步研究益生菌的分子生物学和功能特性提供了基础。

GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞的研究

目的以电穿孔法,将GFP质粒转染SGC7901/ADM细胞,优化转染条件以得到较高的转染率。方法在400μl电转染体系中,以不同的电场强度(150 V、180 V、210 V和240 V),脉冲时间(5 ms、25 ms、50 ms和75 ms),电场强度和脉冲时间(150 V,75 ms;180 V,50 ms;210 V,25 ms;240 V,5ms),分别将GFP质粒电转染SGC7901/ADM细胞,并检测不同条件下细胞的存活率和转染率。结果 180V/50 ms和210V/25 ms的条件下,均能取得较好的电转染效果。

流体力学注射介导的重组pcDNA-IFN-λ3-EGFP质粒在小鼠体内的表达

目的研究流体力学尾静脉注射对目的基因器官靶向性的影响。方法将BALB/c小鼠按随机数字表分组法分为流体力学注射组和空质粒对照组。流体力学注射组将100μg/只带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达质粒pcDNA-IFN-λ3-EGFP溶液2ml在5s内快速注入尾静脉,对照组在5s内注入空质粒pcDNA3.1的生理盐水2ml。注射后在不同时间内用过量麻醉剂处死小鼠,取肝、肺、肾、心、脑等组织作冰冻切片,于荧光显微镜下观察。结果流体力学注射pcDNA-IFN-λ3-EGFP质粒在肝组织中表达IFN-λ3-EGFP融合蛋白,注射8h后即有较强的表达,24h后表达最强,2d后明显减弱,1周后消失。其他组织及对照组未检测到绿色荧光蛋白表达。结论流体力学注射方法是肝靶向性的活体基因转移方法,绿色荧光蛋白可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂。

伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒 (PseudorabiesVirus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上 ,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因 5’端 363bp,同时把绿色荧光蛋白 (GFP)基因表达盒插入到缺失部分 ,并在下游引入一个多克隆位点 ,构建了缺失转移载体pgEI GFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEI GFP转染了感染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。

肉葡萄球菌tat-gfp融合基因的构建与表达

将PCR扩增的肉葡萄球菌铁离子过氧化物酶基因(fepB)的双精氨酸转运(Tat)信号肽DNA序列与绿色荧光蛋白基因(gfp)亚克隆到pCX9质粒中构建可表达的tat-gfp融合基因,再将形成的pCX19-Tat-GFP质粒电转化转入肉葡萄球菌宿主中。提取阳性克隆子质粒进行酶切验证,表明表达载体pCX19-Tat-GFP成功地构建并转化。用木糖诱导重组菌株后,分别使用荧光显微镜和SDS-PAGE检测外源GFP蛋白的表达分泌情况。结果显示,菌体能够发出绿色的荧光,且蛋白电泳能够在细胞质与细胞壁组分中检测到GFP蛋白条带,表明肉葡萄球菌宿主可以将表达载体pCX19-Tat-GFP表达的GFP在细胞质中正确折叠,并以活性形式转运到细胞壁部分。

双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用

目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-I比值;单荧光GFP-LC3质粒和双荧光mRFP-e GFP-LC3质粒转染HEK293细胞,雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h,采用荧光显微镜统计,并比较两种方法转染后HEK293细胞内LC3亮点的变化。结果:不同浓度雷帕霉素处理HEK293细胞,LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加;转染GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色亮点的数量增加;转染mRFP-e GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色和红色亮点数量均增加。结论:双荧光mRFP-e GFP-LC3体系优于单荧光GFP-LC3体系,更能全面完整地反映细胞自噬水平,能够反映细胞内自噬流的变化,是自噬定量分析的可靠方法。

含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建

[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。

UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇制备及其表达分析

黑腹果蝇作为经典遗传学和分子遗传学模式生物,已经成为研究基因调控器官发育以及各种疾病发生的一个强有力的模型。为了探究Mlp84B在果蝇体内的表达定位及互作蛋白质,首先将含启动子元件的果蝇Mlp84B基因组融合GFP序列克隆至pUAST表达载体中,利用胚胎显微注射技术将构建好的重组质粒注射到果蝇早期受精卵;其次通过杂交获得红眼果蝇,经单果蝇建系、平衡子定位后获得稳定遗传的转基因果蝇;最后通过在果蝇体内检测到GFP的表达,同时经qRT-PCR检测到Mlp84B的表达水平上升,证实转基因果蝇构建成功。GFP定位结果显示,内源Mlp84B在果蝇肌肉系统表达,并且Mlp84B与Act57B在果蝇体内相互作用。实验结果表明,文中构建的UAS-Mlp84B-GFP转基因果蝇可以作为肌肉的标记品系,这为探究肌肉系统形成和稳态奠定了基础。

质粒载体系统介导的人肿瘤细胞RNA干扰作用

目的研究质粒载体介导的肿瘤细胞RNA干扰效果.方法构建以H1 RNA为启动子的针对GFP基因不同序列片段的RNAi质粒pLasRiGFP1/2/3.将其与pcdna3.1EGFP共转染HEK293、Hela和SPCA1细胞或单独转染SPCA1-GFP,用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析GFP表达.结果 pLasRiGFP1、pLasRiGFP2和pLasRiGFP3在HEK293中对GFP表达的抑制率分别为97.5%、97%和89%,Hela细胞中为83%、90%和90%,SPCA1细胞中为65%、55%和40%.pLasRiGFP1与pLasRiGFP2在SPCA1-GFP细胞对GFP的抑制率分别为53%和58%.RNAi作用在48～96 h最强,并随RNAi质粒增加抑制效果呈增强趋势,但到达一定量后作用趋势平缓.结论 H1 RNA为启动子的RNAi质粒能有效介导肿瘤细胞RNAi,其作用存在剂量和时间效应,受靶序列、细胞类型等因素的影响.

流式细胞术结合G418筛选重组质粒稳定转染细胞

目的:探索优化重组质粒转染细胞后的筛选方法,以得到高纯度U937转染细胞。方法:选择带Neor及GFP基因的质粒pRNATU6.1/Neo。根据流式细胞仪可分选GFP阳性细胞这一特点,在质粒转染细胞后比较单用G418筛选与合并使用流式细胞仪分选后的筛选效果。结果:单用G418筛选时最高筛选效率为72.0%;合并使用G418及流式细胞仪分选后的筛选效率均在90.0%以上。结论:合并使用G418及流式细胞仪分选是一种高效的筛选方法。

降解-示踪质粒的构建及性能评价研究

在生物强化中采用报告基因技术对降解质粒进行标记,可实现对基因工程菌和降解基因的原位监测。通过基因克隆技术,将绿色荧光蛋白基因(gfp)和阿特拉津脱氯水解酶基因(atzA)重组,构建降解-示踪功能质粒,实现对阿特拉津降解质粒的示踪标记,并对转化获得的基因工程菌绿色荧光蛋白表达及阿特拉津降解能力进行评价。结果表明将gfp和atzA基因克隆至质粒载体pUC18所获得的重组质粒,经检测含有atzA基因,具有氨苄青霉素抗性,并可表达绿色荧光蛋白。携带重组质粒的基因工程菌具有阿特拉津降解活性;且在活性污泥中产生绿色荧光现象,可通过原位观察进行监测。

以UPS构建的重组酿酒酵母表达载体及其稳定性研究

采用通用载体质粒融合系统UPS构建了一种以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体pYES-GFP,并研究了其在重组酿酒酵母中的稳定性。实验表明,所构建的附加型质粒pYES-GFP在经近100代传代后,仍未发生丢失,具有良好的稳定性。同时,通过实验验证了,UPS在进行表达载体构建时快速、简便、高效。

以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的酿酒酵母表达载体。方法利用通用载体质粒融合系统(UPS),首先将GFP片断连入donor载体,随后在Cre酶作用下与acceptor载体融合,获得了带有GFP片断的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)表达载体。结果成功构建了以GFP为报告基因的酿酒酵母载体,并在酵母中得到表达。结论GFP是一种理想的报告基因。同时,利用UPS能够高效、简便地进行酵母表达载体的构建。

一株微生物采油菌的16S rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

筛选到一株高效生产多糖的YX菌,油田先导试验证明该菌可以用于微生物调剖提高原油采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR).经16SrDNA分析鉴定,YX菌属于肠内杆菌属(Enterobacter.),为跟踪监测其动态信息,构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组质粒pET-30a(+)-EGFP,利用CaCl2法将其转化至YX菌,利用荧光显微镜可以观察到重组YX(GFP)工程菌的绿色荧光.结果表明YX菌可以被绿色荧光蛋白基因标记,用于微生物采油研究.

猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞及转染效率的研究

目的采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究。方法猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率。绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况。分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24h和48h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率。结果猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670%,传代培养后细胞存活率95.670%,复苏细胞存活率仍在90%以上。原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈"S"型,复苏细胞生长略微缓慢。原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈"S"型曲线。Neon电转染后24h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01%,稍高于传代细胞的7.91%和复苏细胞的7.86%。复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86%GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义。结论猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力。原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达。原代培养细胞具有更佳的细胞活力和阳性转染率,进行基因敲除或基因敲入等基因编辑和体细胞克隆研究,选择原代细胞作为转染对象能获得更好的基因编辑成功率。

不同转染条件影响质粒转染效率的探讨

目的通过插入不同片段质粒、不同剂量的转染,研究GFP基因转染效率的变化。方法构建插入不同片段的载体,以不同条件转染HeLa细胞,以Northern blot分别检测转染入细胞中各个质粒的表达水平。结果 2.0×105/mL细胞浓度的转染效率高于1.0×105/mL细胞浓度;固定转染质粒和脂质体的比值,转染效率随转染复合物量的上升而增加;固定脂质体的量,C1-ORF2、C1-ORF2as和C1-280-1×14as随转染剂量的增加,转染效率先升高再下降或表现持平。结论转染质粒的种类、剂量及转染细胞浓度影响转染质粒报告基因表达。

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。