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表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定
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作者 章丽娇 田宇杰 +9 位作者 张兰香 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 吴凤瑶 刘青涛 刘宇卓 张小飞 李银 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期44-50,共7页
报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。 展开更多
关键词 坦布苏病毒 绿色荧光蛋白 报告病毒
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一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
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作者 左东 李子晨 +5 位作者 尹伊 胡海 王少辉 祁晶晶 田明星 于圣青 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第4期25-31,共7页
细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究... 细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。 展开更多
关键词 诱导表达质粒 绿色荧光蛋白 大肠杆菌 沙门菌 布鲁菌
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表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化
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作者 郭禹 程晶 +2 位作者 左玉柱 范京惠 姜海军 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2091-2100,共10页
【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。 展开更多
关键词 C型禽偏肺病毒 迷你基因组 反向遗传系统 CMV启动子 增强绿色荧光蛋白 T7启动子
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利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系
4
作者 董依萍 刘画 +3 位作者 刘丹 周迎佳 李峰 邓颖天 《广东农业科学》 CAS 2024年第3期103-113,共11页
【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘... 【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。 展开更多
关键词 辣椒 Flamingo-bill外植体 绿色荧光蛋白 遗传转化 农杆菌 组织培养
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脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建
5
作者 徐超 杨晓炼 朱书 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期218-224,共7页
携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感... 携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 增强绿色荧光蛋白 嵌合病毒
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绿色荧光蛋白(GFP)研究进展 被引量:51
6
作者 汪恒英 周守标 +2 位作者 常志州 马艳 秦卫华 《生物技术》 CAS CSCD 2004年第3期70-72,共3页
源于多管水母属 (AequoriaVictoria)等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP)是一种极具潜力的标记物 。
关键词 多管水母 无脊椎动物 绿色荧光蛋白(gfp) 标记
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农杆菌介导稻瘟病菌绿色荧光蛋白(GFP)遗传转化研究 被引量:12
7
作者 张俊华 刘烨 +4 位作者 韩雨桐 潘春清 王中业 张淋淋 崔凯旋 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1-7,共7页
稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应... 稻瘟病是水稻生产中的主要病害,抗病品种选育和利用是控制稻瘟病最有效措施。研究稻瘟病菌与水稻品种互作机制是培育抗病品种的基础。GFP(Green fluorescent protein)基因因其具有片段小、易与多种不同蛋白质N端或C端融合等特点,广泛应用于病菌与寄主植物互作研究中。研究以p BGg Hg作为转化载体,根癌农杆菌C58C1作为转化介体,转化稻瘟病菌的强致病菌株py1022。研究发现,250μg·m L-1潮霉素B能完全抑制稻瘟病菌生长,利用根癌农杆菌介导稻瘟病菌遗传转化的最佳条件为:稻瘟病菌分生孢子浓度为1×105个·m L-1,共培养时间为4 d,共培养AS浓度为200μmol·m L-1,共培养温度为28℃。随机挑取8个转化子分别进行PCR扩增后测序、荧光显微镜下观察、致病力及稳定性测定,结果表明GFP成功转化到稻瘟病菌中,可为稻瘟病菌与水稻品种的互作机制研究提供技术支撑。 展开更多
关键词 稻瘟病菌 农杆菌介导遗传转化 绿色荧光蛋白(gfp)
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用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选有效的siRNA 被引量:12
8
作者 单志新 林秋雄 +3 位作者 符永恒 邓春玉 李晓红 余细勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期231-235,共5页
建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子AT... 建立一种利用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的MIF-GFP融合表达载体pEGFP-MIF.分别将3个靶向MIF的siRNA表达质粒与pEGFP-MIF共转化HEK293细胞,在荧光显微镜下观察HEK293细胞中GFP的表达,并用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.同时,将MIFsiRNA表达质粒分别与MIF表达载体共转化HEK293细胞,用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.定量PCR结果显示,GFP表达低的细胞中,MIF mRNA的表达也明显降低;利用pEGFP-MIF和MIF表达载体筛选到的有效MIFsiRNA的结果一致.因此,建立了目的基因与GFP融合表达,以GFP作为报告分子来筛选抑制目的基因表达siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案. 展开更多
关键词 RNA干扰 荧光定量PCR 绿色荧光蛋白 载体
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利用绿色荧光蛋白(GFP)标记香蕉枯萎病菌及其稳定性检测 被引量:6
9
作者 刘勇勤 李赤 +2 位作者 徐秀德 刘菲菲 于莉 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期15-18,共4页
利用PEG-CaCl2介导的原生质体法将携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的质粒pSC001转化进香蕉枯萎病菌中,荧光显微镜观察结果显示,转化子在蓝光光源的激发下,菌丝及孢子均能产生稳定的绿色荧光,表明GFP基因已成功转化至... 利用PEG-CaCl2介导的原生质体法将携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的质粒pSC001转化进香蕉枯萎病菌中,荧光显微镜观察结果显示,转化子在蓝光光源的激发下,菌丝及孢子均能产生稳定的绿色荧光,表明GFP基因已成功转化至香蕉枯萎病菌并获得表达。将GFP标记的病原菌进行连续继代培养和接种巴西蕉,结果表明:GFP的导入对病原菌的遗传稳定性和致病性没有显著影响。 展开更多
关键词 香蕉枯萎病 绿色荧光蛋白gfp 基因转化 原生质体
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根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白(GFP)基因植株再生 被引量:16
10
作者 汪波 彭定祥 +2 位作者 孙珍夏 张娜 邢秀龙 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第10期1606-1610,共5页
以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再... 以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。 展开更多
关键词 苎麻 根癌农杆菌 遗传转化 绿色荧光蛋白
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绿色荧光蛋白(GFP)在真菌研究中的应用 被引量:13
11
作者 徐进 莫明和 张克勤 《生物技术》 CAS CSCD 2004年第6期74-77,共4页
绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)来源于海洋生物水母 (Aequoreavictoria) ,由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点 ,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真... 绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)来源于海洋生物水母 (Aequoreavictoria) ,由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点 ,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法 ,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等 ;GFP基因通过与目标基因融合的方法 ,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白(gfp) 真菌 报告基因
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橙色荧光蛋白——绿色荧光蛋白GFPxm的改造 被引量:4
12
作者 罗文新 陈敏 +5 位作者 程通 管宝全 李少伟 李少菁 张军 夏宁邵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期56-62,T001,共8页
最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因。经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白 (GFPxm)具有 4 76nm的激发峰和 4 96nm的发射峰 ,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用。这里进一步报道GFPxm的 12种突变型。在大肠杆菌中... 最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因。经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白 (GFPxm)具有 4 76nm的激发峰和 4 96nm的发射峰 ,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用。这里进一步报道GFPxm的 12种突变型。在大肠杆菌中的表达结果表明 ,有 7种突变型在 37℃条件下产生高的荧光强度。在 2 5、32和 37℃条件下表达 6h ,GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) ,而GFPxm16和GFPxm16 3在 4 2℃高温表达时仍能保持高的荧光强度。这 7种突变型中的 4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达。此外 ,有 6种突变型的荧光光谱红移 ,目前所达到的最长激发峰为 5 14nm、最长发射峰为 5 2 5nm。另外有 3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰 ,1种突变型只有单一的紫外激发峰。首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm ,它的激发峰为 5 0 9nm、发射峰为 5 2 3nm。 5 2 3nm属于黄绿色 ,但肉眼看到的蛋白为橙色。OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟 ,但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低。 展开更多
关键词 橙色荧光蛋白 绿色荧光蛋白 gfpxm 改造 基因标记 突变型 荧光光谱 荧光强度
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不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建
13
作者 张峰程 张君 +1 位作者 李凡 郭维 《云南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期35-43,共9页
【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基... 【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。 展开更多
关键词 拟轮枝镰孢菌 PEG介导 绿色荧光蛋白 红色荧光蛋白 交配型
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表达绿色荧光蛋白嵌合狂犬病病毒HEP-GFP株的拯救 被引量:9
14
作者 刘晓慧 艾军 +2 位作者 郭霄峰 孙京臣 梁红茹 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期401-403,共3页
Green fluorescent protein(GFP)gene was inserted into the pseudogene(ψ)region of genome of rabies virus rHep-Flury strain,and a recombinant rabies virus carrying GFP,designated as HEP-GFP,was rescued by reverse geneti... Green fluorescent protein(GFP)gene was inserted into the pseudogene(ψ)region of genome of rabies virus rHep-Flury strain,and a recombinant rabies virus carrying GFP,designated as HEP-GFP,was rescued by reverse genetics system.It was demonstrated that green fluorescent protein could be expressed in the chimeric virus after 5 passages in BHK-21 cell line.The research indicated that the pseudogene(ψ)region in the genome of rHEP-Flury strain,as an independent functional unit in the process of virus assembly,could independently carry and express exogenous genes. 展开更多
关键词 狂犬病毒 嵌合病毒 绿色荧光蛋白
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绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用 被引量:49
15
作者 吴沛桥 巴晓革 +1 位作者 胡海 赵静 《生物医学工程研究》 2009年第1期83-86,共4页
源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP),是一种极具应用潜力的标记物,有着极其广泛的应用前景。我们就GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
关键词 绿色荧光蛋白(gfp) 标记物 荧光特性 进展 改进 应用
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绿色荧光蛋白基因gfp在苏云金芽胞杆菌中表达的初步研究 被引量:3
16
作者 周琴 孙明 +1 位作者 周俊初 喻子牛 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2003年第8期981-984,共4页
将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的gfpmut3a基因克隆到穿梭载体pHT30 4后 ,电转化至苏云金芽胞杆菌BMB171,CryB、IPS78 11、4Q7、HD 80 2 1中。通过荧光显微镜和Bio assayReader对含重组质粒pGFP 30 4的 5个受体菌分别进行荧光检测及定... 将携带蜡状芽胞杆菌特异启动子的gfpmut3a基因克隆到穿梭载体pHT30 4后 ,电转化至苏云金芽胞杆菌BMB171,CryB、IPS78 11、4Q7、HD 80 2 1中。通过荧光显微镜和Bio assayReader对含重组质粒pGFP 30 4的 5个受体菌分别进行荧光检测及定量分析。结果表明 ,gfpmut3a基因仅在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171、CryB、IPS78 11、4Q7中表达并可检测得到菌体发光 ,并建立了一套适合于苏云金芽胞杆菌的GFP标记与检测方法。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白基因 gfp 苏云金芽胞杆菌 基因表达 细菌杀虫剂 生物农药 遗传工程菌
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绿色荧光蛋白gfp基因在钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株中的表达 被引量:3
17
作者 张海生 叶霁 +3 位作者 唐欣昀 王芬 曹媛媛 张明 《激光生物学报》 CAS CSCD 2008年第1期59-63,共5页
将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株在24℃培养,经2 mmol/L的EDTA预处理24 h;采用功率300 W的超声波处理70 s获得单细胞样品,以本实验室构建的携带gfp基因的质粒p215t转化A9藻株单细胞藻液,利用Amp作为选择标记,使单细胞在平板上... 将钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)A9藻株在24℃培养,经2 mmol/L的EDTA预处理24 h;采用功率300 W的超声波处理70 s获得单细胞样品,以本实验室构建的携带gfp基因的质粒p215t转化A9藻株单细胞藻液,利用Amp作为选择标记,使单细胞在平板上再生长出单藻落,获得17株具有Amp抗性的转化藻株,转化率3.73‰。在390 nm紫光激发下,生长30天的转化藻丝体发出稳定绿色荧光;培养45天后具有绿色荧光的藻丝出现断裂、具有荧光藻丝长度缩短的现象。实验结果初步表明:报告基因gfp在螺旋藻中得到稳定有效的表达,可以采用单细胞再生形成单藻落技术进行螺旋藻的基因克隆。 展开更多
关键词 钝顶螺旋藻 gfp基因 转化 单细胞再生 绿色荧光
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橡胶树尖孢炭疽菌绿色荧光蛋白(GFP)标记转化株的获得 被引量:9
18
作者 林春花 刘先宝 +3 位作者 蔡吉苗 李超萍 李继锋 黄贵修 《热带作物学报》 CSCD 2009年第10期1495-1500,共6页
建立了根癌农杆菌介导转化橡胶树尖孢炭疽菌(Collectotrichum acutatum)获得T-DNA插入突变体的体系:在尖孢炭疽菌孢子浓度106个/mL、农杆菌浓度OD600=0.15~0.2后在200μmol/mL的乙酰丁香酮(AS)诱导6h,共培养48h,转化效率可达150~300个... 建立了根癌农杆菌介导转化橡胶树尖孢炭疽菌(Collectotrichum acutatum)获得T-DNA插入突变体的体系:在尖孢炭疽菌孢子浓度106个/mL、农杆菌浓度OD600=0.15~0.2后在200μmol/mL的乙酰丁香酮(AS)诱导6h,共培养48h,转化效率可达150~300个/106个分生孢子。获得的转化子通过PCR检测绿色荧光蛋白基因、Southern杂交验证、分生孢子的荧光观察,结果表明:被测转化子基因组中确实整合了目的片段,成功获得了橡胶树尖孢炭疽菌菌株CHY-1绿色荧光蛋白标记转化子。 展开更多
关键词 根癌农杆菌 尖孢炭疽菌 遗传转化 T-DNA 绿色荧光蛋白
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绿色荧光蛋白标记的表达载体pHis-EGFP的构建 被引量:3
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作者 王伟 孟超 +1 位作者 朱平 程克棣 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第9期35-39,共5页
为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载... 为对重组蛋白的表达进行直观检测并简化蛋白纯化的步骤,构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体pHis-EGFP。该载体含有源自表达载体pET-32a的T7启动子、终止子和源自质粒pUC18的ColE1复制子与绿色荧光蛋白报告基因。应用该载体成功地表达并纯化了酵母GGDP(geranylgeranyldiphosphate,GGDP)合酶融合蛋白,结果表明所构建的载体是一个实用的表达载体,并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法。 展开更多
关键词 表达载体 绿色荧光蛋白(Egfp) GGDP合酶 绿色荧光蛋白标记 构建 蛋白纯化 融合蛋白 离子交换层析 T7启动子 PUC18
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利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性 被引量:5
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作者 周琴 孙明 喻子牛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期543-546,共4页
利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P4 4- 1 2 以研究其表达差异。其中 ,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融... 利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P4 4- 1 2 以研究其表达差异。其中 ,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因 ,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_30 4 (含P4 4- 1 2 )、pGFPExpA(含Pcry3A_gf pmut3融合基因 )和pGFPExpB(含PBtI_BtII_gfpmut3融合基因 )分别导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)和苏云金芽胞杆菌后发现 ,P4 4- 1 2 和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A 不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达 ,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_30 4、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明 ,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB1 71中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P4 4_1 2 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 基因 芽胞杆菌 启动子 荧光活性检测 微量热
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