梨炭疽病菌原生质体遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

为建立梨炭疽病菌的原生质体遗传转化体系,以梨炭疽病菌菌株II-17为供试菌株,研究了菌龄、酶解液组合及酶解时间等对梨炭疽病菌原生质体制备的影响。结果表明,制备梨炭疽病菌原生质体的适宜条件为:CM液体培养基培养分生孢子24 h后,再转接到新的CM液体培养基中培养24 h,获得新鲜的菌丝;最适酶解液组合为9.0 mg/ml裂解酶+1.0 mg/ml崩溃酶+1.0 mg/ml蜗牛酶;酶解时间为2.5~3.0 h时酶解效率最高。对获得的转化子进行PCR鉴定和荧光观察,结果表明,GFP标记基因已成功整合到梨炭疽病菌的基因组中,转化子发出强烈的绿色荧光且遗传性稳定。致病性测定结果表明,转化子致病性与野生型菌株无明显差别,成功获得了梨炭疽病菌的GFP标记菌株。

线虫拮抗菌BC2000的分子鉴定及其GFP标记菌的生物学特性

用16S rRNA基因克隆及测序的方法对抗线虫生防菌BC2000进行分子鉴定,根据序列比对结果确定该菌株为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis),并在GenBank中获得序列号AY662683.对gfp标记菌BC2001主要生物学特性进行分析,结果表明:与野生菌株BC2000相比,标记菌BC2001生长较慢;对温度的敏感性增强,但不影响菌株培养的最适宜生长温度和最适宜pH.而标记菌株BC2001在非选择性LB培养基中连续转接10次后外源基因gfp表达的荧光稳定性还保持在100%.