嗜酸乳杆菌GGDEF和EAL结构域相关蛋白的表达、纯化及活性分析

目的鉴定嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能。为进一步研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)在该菌株中的调控机制奠定基础。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13_07055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒。经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物。结果通过PCR扩增的目的基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果与Gen Bank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功。SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000(含GGDEF结构域)、67000(含EAL结构域)和72000(含EAL结构域),与预期大小吻合。经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的蛋白。高效液相色谱分析结果显示,NH13_07045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶(DGC)活性,NH13_07050的表达产物体外具有磷酸二酯酶(PDE)活性,而NH13_07055的表达产物在体外无明显PDE活性。结论在本研究的3种基因中,NH13_07050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶(PDE)的活性。为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据。

十字花科黑腐病菌中GGDEF结构域蛋白差异的insilico分析

近年来,含有GGDEF结构域(含有甘氨酸(G)(2个),天冬氨酸(D),谷氨酸(E),苯丙氨酸(F)保守氨基酸)的蛋白受到重视,已证实含GGDEF结构域蛋白在细胞信号转导、生长和致病性等方面发挥了重要作用。十字花科黑腐菌8004菌株(Xanthomonas campestrispv.campestris str.8004,Xcc 8004)有32个基因编码含GGDEF结构域蛋白,实验证明其中部分蛋白与Xcc致病性、胞外酶产生、生物膜形成和泳动等生命活动相关。本文利用互联网提供的生物信息学资源,对Xcc8004不同功能含GGDEF结构域蛋白进行生物信息学分析,着重分析其结构域架构。对蛋白结构域架构整体比较显示,这些蛋白的整体结构域架构具有多样性,共有结构域架构仅有PAS_4-GGDEF-EAL(分布于参与致病的蛋白中);对结构域架构局部比较显示,在参与致病性的含GGDEF结构域蛋白中,PAS_4-GGDEF和GGDEF-EAL为共有结构域架构;在参与内切葡聚糖酶产生的蛋白中,PAS_4-PAS_4、PAS_4-GGDEF和GGDEF-EAL为共有结构域架构。本研究结果将为蛋白质功能预测提供线索。

普城沙雷氏菌pigX基因的生物信息学分析

通过生物信息学方法对普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3菌株中GGDEF/EAL结构域蛋白编码基因pigX启动子区域的调控信息以及编码蛋白质的理化特性和结构特点进行了解析。利用启动子分析软件Softberry和Neural Network Promoter Prediction对pigX基因编码区上游序列进行启动子预测,利用生物信息学方法对PigX蛋白的氨基酸组成和理化特性、磷酸化和糖基化位点、跨膜结构、信号肽二级结构和保守结构域等进行预测分析。结果显示:pigX启动子区有Fur和SoxS结合位点;PigX是微亲水性的脂结合蛋白,具有信号肽和跨膜结构域、糖基化和高水平磷酸化位点,α-螺旋和无规则卷曲是其主要二级结构。生物信息学分析预测结果表明G3菌株PigX具有较高水平磷酸化位点及由α-螺旋和无规则卷曲组成的二级结构,这与预测的PigX参与铁代谢和氧化应激反应及作为Csr D同源物与CSRB家族sRNAs分子结合的功能相吻合。

铜绿假单胞菌PAO1中4个具有GGDEF-EAL结构域基因的研究

目的对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)野生型PAO1中与环鸟苷二磷酸(C-di-GMP)代谢相关的4个具有GGDEF-EAL结构域基因(PA0285、PA0575、PA5295、PA5442)进行初步研究。方法分析4个基因的转座子突变菌株进行生物膜(Biofilm)及泳动性(Motility);利用PCR对4个基因的催化结构域进行克隆并构建原核表达载体,经IPTG诱导后检测重组蛋白的表达情况。结果生物膜分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体较野生型PAO1间生物膜合成发生变化,其A值差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05);PA5295转座子突变体与PAO1间生物膜合成差异无统计学意义(P=0.232,P>0.05);泳动性分析显示,PA0285、PA0575、PA5442的转座子突变体菌落直径与PAO1比较差异有统计学意义(P=0.000,P<0.05),PA5295的转座子突变体与PAO1间比较差异无统计学意义(P=0.083,P>0.05)。4个基因的催化结构域原核表达载体构建成功,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。结论初步分析表明PA0285、PA0575、PA5442均影响细菌的生物膜合成及运动性,为4基因的功能研究奠定了基础。

茎瘤固氮根瘤菌ORS571 GGDEF和EAL结构域蛋白的预测及功能研究（英文）

【目的】环二鸟苷酸c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,能够调控多种细胞功能。c-di-GMP的合成与水解分别由含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白催化。本研究针对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的GGDEF和EAL结构域相关蛋白进行基因组学分析,并对三个同时含有GGDEF和EAL结构域的蛋白(AZC3085、AZC3226和AZC4658)进行功能研究。【方法】利用SMART数据库对含有GGDEF和EAL结构域的蛋白进行结构域预测。利用CLUSTALW程序对蛋白序列进行比较分析。通过同源重组的方法构建突变株,并对突变株的细胞运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与豆科宿主的结瘤等表型进行测定。【结果】茎瘤固氮根瘤菌ORS571中一共存在37个GGDEF和EAL结构域蛋白。突变株?4658的运动能力较野生型有下降,但是其胞外多糖合成能力、生物膜形成能力和竞争性结瘤能力较野生型有提高。此外,实验结果表明突变株?4658的胞内c-di-GMP水平高于野生型。突变株?3085和?3226的各种表型与野生型相比没有明显差异。【结论】茎瘤固氮根瘤菌ORS571编码如此大数量的GGDEF和EAL结构域蛋白,表明c-di-GMP可能在其信号转导过程中起到非常重要的作用。同时具有GGDEF和EAL结构域的蛋白AZC4658对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与宿主的结瘤起到一定的调节作用。

鱼腥蓝细菌PCC7120 alr3504基因缺失突变体的构建及表型分析

c-di-GMP是新发现的真细菌所特有的第二信使,其合成和降解由双鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶分别完成。经生物信息学分析,鱼腥蓝细菌PCC7120基因alr3504可能编码含有保守GGDEF结构域的双鸟苷酸环化酶。【目的】为了鉴定该基因的功能,【方法】采用标记置换方法将alr3504缺失。【结果】敲除该基因后,发现缺失突变体的形态、生长速度及异形胞发育与野生型无明显差异,但在盐胁迫条件下,突变体比野生型对钠盐更敏感。【结论】可见alr3504虽不直接影响异形胞发育,但参与了其它信号途径,研究结果为阐明蓝细菌丰富而复杂的信号转导机制奠定了基础。

GGDEF结构域在c-di-GMP代谢中的作用及其结构基础

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate monophosphate,c-di-GMP)是一种重要的第二信使,可调节细菌的各种生命活动,包括生物膜形成、细胞分化、菌体运动和毒力因子产生等。在c-di-GMP代谢过程中,GGDEF结构域发挥重要作用。一方面,GGDEF结构域广泛存在于二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclases,DGCs)上,催化c-di-GMP的合成;另一方面,GGDEF结构域也可与EAL等结构域串联,参与c-di-GMP的分解。该文系统介绍了c-di-GMP的代谢过程及其生理作用,重点论述了GGDEF结构域有效调控c-di-GMP代谢的结构基础和机制,并讨论了该领域研究的应用价值与未来方向。

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P<0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P>0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P<0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P<0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P<0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。

鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使c-di-GMP相关代谢蛋白的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法分析鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使环鸟苷-磷酸(c-di-GMP)相关代谢蛋白,预测其性质和编码功能。方法通过在线数据库NCBI查找鲍曼不动杆菌基因组,从中筛选出含有GGDEF/EAL结构域的蛋白,通过MEGA4.0软件构建进化树进行分析,利用Swiss-Model软件分析该蛋白的三级结构。结果Blast比对显示ATCC17978中含有GGDEF/EAL结构域和c-di-GMP代谢相关的候选蛋白12个,其中含有GGDEF结构域的蛋白10个,含有EAL结构域的蛋白5个,同时含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白3个。蛋白序列分析含有GGDEF/EAL结构域的蛋白可以分为两类,其中5个蛋白质含有I位点。结构预测分析7个蛋白中含有1个或多个跨膜结构域,其中3个蛋白无跨膜结构域。三级结构预测出9个可信度较高的蛋白。结论鲍曼不动杆菌ATCC17978含有12个与c-di-GMP代谢相关GGDEF/EAL结构域蛋白,为探索c-di-GMP代谢网络奠定了基础。