柑橘GGP基因家族生物信息学分析

GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphorylase, GGP)是植物抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)生物合成的一个关键酶。本研究利用生物信息学分析技术从克里曼丁橘基因组数据库中鉴定到4个GGP基因序列,分别位于4条不同染色体上,均含有内含子,氨基酸个数为307~455个,蛋白质二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。顺式作用元件预测柑橘GGP基因家族参与光、逆境胁迫和植物生长等响应。转录组数据显示,CsGGP2和CsGGP4是柑橘AsA生物合成起作用的家族成员,CsGGP2是主导成员,参与果皮早期发育;CsGGP4协同参与须根黄龙病胁迫。上述结果为进一步确定柑橘GGP家族基因的功能奠定基础。

刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析

高含量的维生素C是刺梨果实的重要性状,挖掘与维生素C含量相关联的基因序列变异及单倍型对刺梨的品种改良具有指导意义。在21份野生刺梨资源中对GGP和DHAR基因进行PCR扩增和测序,分析基因序列多态性及其与果实维生素C含量的相关性。GGP基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2035 bp的同源序列,其中包含22处变异位点,产生15种单倍型,在0.01显著性水平上,3个单核苷酸多态性(SNP)及Hap15与刺梨果实高含量维生素C相关;在0.05显著性水平上,3个SNP及Hap7与刺梨果实低含量维生素C相关;GGP基因单倍型存在网状进化。DHAR基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为1609 bp的同源序列,其中包含69处变异位点,产生9种单倍型,在0.05显著性水平上,8个SNP、9个InDel及Hap9与刺梨果实中低含量维生素C相关,1个SNP及单倍型Hap4~Hap6与刺梨果实中高含量维生素C相关;DHAR基因单倍型呈现扇形进化。GGP基因具有更高的单倍型多样性,DHAR基因具有更高的DNA多态性;GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4共同存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

猕猴桃维生素C的合成规律及关键基因鉴定研究

本研究以3个不同杂交猕猴桃(Actinidia)群体的果实为材料,测定果实不同发育时期的维生素C(Vc)含量;采用实时荧光定量法PCR法分析猕猴桃Vc合成关键基因的表达情况;对发掘的关键基因GGP开展蛋白结构、理化性质和亲水性和疏水性分析,并在杂交群体中验证GGP基因对于后代果实Vc合成的调控作用。结果显示,当高Vc的猕猴桃物种作为亲本时,杂交子代Vc含量在早期(花后60 d)达到最大值,再随着果实发育而逐渐降低;当中低Vc含量的猕猴桃物种作为亲本,其后代果实Vc含量一直较低且发育规律与母本相似。Vc合成相关基因中,仅有GGP基因在高Vc杂交群体中的表达量均显著高于低Vc杂交群体。在GGP的3个同源基因中,GGP1和GGP3的蛋白质二级、三级结构、理化性质以及亲、疏水性高度相似;但GGP2与前者存在较大的差异。在3个杂交群体后代果实中采用关联分析验证GGP1和GGP3的功能发现,GGP3基因对杂交后代果实的Vc合成可能具有最为重要的作用。研究结果表明,不同猕猴桃杂交群体Vc含量的合成规律存在差异,GGP3基因可能对不同杂交群体后代果实的Vc合成具有重要影响。

绿色杜氏藻DvGGPS生物信息学及转录差异研究

香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶(GGPS)能够催化焦磷酸异戊烯酯(IPP)与二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)反应形成二萜化合物通用前体香叶酰基香叶酰焦磷酸(GGPP)。为深入了解GGPS蛋白在类胡萝卜素合成途径中的作用,通过Illumina Hi Seq TM 2000高通量测序获得Dv GGPS基因c DNA全长序列,对GGPS基因序列进行生物信息学分析,并研究花生四烯酸(AA)、乙酰水杨酸(ASA)和硫酸铈铵(ACS)对Dv GGPS基因转录水平的影响及绿色杜氏藻类胡萝卜素含量变化。生物信息学分析结果表明,Dv GGPS基因c DNA全长2 229 bp,含1 041 bp开放阅读框,编码346个氨基酸。GGPS蛋白质序列理论等电点(p I)为5.82,相对分子质量为37.66 k Da,该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽和跨膜区域。二级结构预测显示该蛋白分子中α-螺旋结构最多,占57.23%。同源比对结果表明,绿色杜氏藻GGPS蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,62.5 mg·L^(-1)AA、50 mg·L^(-1)ASA和0.8 mg·L^(-1)ACS处理的Dv GGPS基因转录水平达到最高,此时类胡萝卜素含量也均有提高,说明绿色杜氏藻类胡萝卜素的生物学合成可能是通过诱导Dv GGPS基因表达实现的,Dv GGPS基因在类胡萝卜素生物合成中起关键作用。Dv GGPS基因的克隆及表达调控研究为今后探明类胡萝卜素积累的分子机理提供了重要参考,也为进一步通过代谢工程手段提高绿色杜氏藻类胡萝卜素含量奠定了理论基础。

西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化

[目的]将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)基因转化西瓜。[方法]利用RT-PCR技术克隆西瓜果实GGPS基因CDS区;构建由果实特异性启动子AGPL1调控GGPS基因、以nptⅡ为筛选标记基因的植物表达载体,并转入农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法对西瓜品种"红一号"进行遗传转化。[结果]经过卡那霉素筛选和PCR初步鉴定,获得4株转基因阳性植株。[结论]构建了GGPS基因果实特异性表达载体,并将其转入西瓜品种"红一号"中,转化效率为0.13%。

转番茄GGPS2基因烟草的构建及弱光耐受性分析

为探讨弱光处理对转番茄Solanum lycopersicon L.GGPS2基因烟草的类胡萝卜素、叶绿素合成及耐弱光性的影响,将Sla GGPS2基因和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)经农杆菌介导转入烟草Nicotiana tabacum L.cv.Wisconsin 38。PCR检测证明抗卡那霉素烟草含有npt II、Sla GGPS2基因,且无农杆菌污染;荧光检测发现,抗卡那霉素烟草的根尖呈现特有的荧光,由此说明获得了整合Sla GGPS2和GFP等外源基因的转基因烟草。弱光处理后,发现转Sla GGPS2基因烟草的类胡萝卜素含量、叶绿素总量、光合速率、单位叶面积重、总干重、根冠干重比均比野生烟草高,达到了差异显著水平。证实Sla GGPS2基因增加了弱光下烟草的类胡萝卜素含量、叶绿素总量,增强了光合速率,促进了生物量积累及其向根部的分配,提高了烟草弱光下的耐受性,推测可用于其他作物的耐弱光性改良。

ggpS基因过表达对集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影响

为了研究甘油葡萄糖苷磷酸合成酶(GgpS)在集胞藻PCC 803甘油葡萄糖苷和甘油合成中的作用,本研究在前期获得高产甘油葡萄糖苷藻株的基础上分别过量表达来自于集胞藻PCC 6803自身和聚球藻PCC7002的甘油葡萄糖苷磷酸合成酶基因ggpS,并测定了在不同浓度NaCl胁迫时突变藻株的甘油葡萄糖苷和甘油积累量。结果发现获得的突变株甘油葡萄糖苷合成没有提高,但是甘油合成显著增强。此外,当培养基NaCl浓度从600 mmol/L提高到900 mmol/L时,集胞藻PCC 6803自身ggpS过表达藻株的甘油合成进一步提高75%。这些结果显示了GgpS在将碳代谢流导入集胞藻甘油合成途径中的作用。研究成果也为进一步通过基因工程改造提高集胞藻甘油葡萄糖苷和甘油合成效率奠定了基础。

穿心莲香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因的克隆与表达

目的从穿心莲中克隆穿心莲内酯合成途径中的香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPS)基因,并进行组织表达等特征研究。方法采用CTAB-LiC1法从穿心莲茎和叶中提取总RNA,简并引物扩增获得保守区段,RACE法获得基因全长,ProtParam等软件分析基因特征,实时荧光PCR法检测不同发育时期穿心莲茎和叶中基因的表达。结果获得了一个长1 047 bp的GGPS基因,编码一条由348个氨基酸组成的蛋白质序列,与长春花的GGPS蛋白亲缘关系较近,N端含有一个由47个氨基酸构成的质体信号肽。在穿心莲的茎和叶中,GGPS基因在花蕾期表达量较高,初花期降低;到了花果混合期表达量升高,青果期下降。表明穿心莲花蕾期和花果混合期相关代谢成分的合成可能更活跃。结论从穿心莲中克隆了GGPS基因,为开展穿心莲内酯合成途径的调控奠定了基础。