能源橡胶草GGPPS基因启动子的克隆及瞬时表达研究

以多年生宿根型草本植物橡胶草为材料,根据已获得的橡胶草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因序列设计引物,采用TAIL-PCR扩增到GGPPS基因5′上游大小为1131bp的序列。采用PlantCare和PLACE软件分析,表明该序列不仅具有启动子的基本元件,同时还有与多个器官特异表达元件以及与胁迫相关的顺式作用元件,命名为pTkGGPPS(GenBank:KT901796)。将该序列代替pCAMBIA1304质粒上的CaMV 35S启动子序列,以GFP基因作为报告基因,构建pCAMBIA1304-pTkGGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,结果表明,该启动子能够驱动GFP基因表达,具有一定的活性。TkGGPPS基因启动子克隆及瞬时表达为橡胶草中橡胶合成及组织特异性研究奠定了基础。

GGPPS基因干扰腺病毒载体的构建及鉴定

构建GGPPS基因干扰腺病毒质粒载体并加以鉴定.根据GGPPS基因序列设计GGPPS干扰序列引物,定向克隆至穿梭载体pshuttle-H1的BglⅡ和HindⅢ位点,PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-H1-SiGGPPS干扰质粒,并与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共同转化E.coli BJ5183感受态细菌,产生重组腺病毒载体.用PacⅠ酶切线性化的回收质粒,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置显微镜下观察细胞CPE,用TCID50法测定病毒颗粒的浓度,并初步观察病毒感染PC12细胞对目的基因的干扰效率.经酶切鉴定、测序证实成功构建GGPPS基因干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.995×107PFU/mL.GGPPS在人中具有保守性,该病毒能在人源的WRL-68细胞中成功表达,并且对GGPPS基因干扰效率达70%以上.

海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析

濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控,通过同源克隆和RACE技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为CmGGPPs(GenBank登录号:JX971119),并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明:海南粗榧GGPPs基因cDNA全长1694bp,包含一个1182bp的ORF框,编码393个氨基酸;预测该基因编码蛋白质分子量为42.91kD,其等电位为7.12。通过BLAST比对结果分析,海南粗榧GGPPs基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达91%,氨基酸序列有89%的相似性。同时,GGPPs基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现,GGPPs在诱导后表达量均上升,但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。

GGPPS基因在植物色香性状改良中的应用研究进展

色彩和香味是影响园林植物观赏品质的重要因子,对植物的观赏价值具有决定性的影响。类胡萝卜素是植物重要色素物质,单萜是植物关键芳香成分,牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPPS)位于两者合成途径的关键交叉节点,对植物颜色、香味相关代谢物的形成具有重要影响。本研究对GGPPS蛋白的结构与分类、进化聚类情况,并对GGPPS基因的转录调控和其他调控因子进行综述,总结了GGPPS基因影响植物色彩与香味形成的作用机制,探讨了其在植物色彩及香味性状改良方面的应用潜力,认为今后可利用多组学手段挖掘相关转录因子并解析GGPPS基因调控植物色香的分子网络,以期为植物观赏性状的遗传改良工作提供新的基因资源和研究思路。

三七GGPPS基因CDS序列克隆及原核表达

目的为研究GGPPS基因在三七中的功能,从三七中克隆GGPPS基因CDS序列,并进行原核表达。方法以3年生三七叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因序列设计引物,利用RT-PCR技术,克隆得到编码区序列;克隆片段连接到p ET-30α(+)表达载体,转入大肠杆菌BL21后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果三七GGPPS基因CDS序列全长1 032 bp,编码343个氨基酸。SDS-PAGE结果表明,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白大小在29 000~44 000,且表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。结论成功克隆了三七GGPPS基因CDS序列,建立了稳定的原核表达体系,为进一步研究其在三七中的生物学功能奠定了基础。

香樟GGPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（geranyl-geranyl pyrophosphate synthetase,GGPPS）的c DNA序列,并进行生物信息学分析,为香樟萜类物质的生物合成及调控机制研究提供基础。根据香樟叶的转录组测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录RT-PCR方法,克隆获得香樟GGPPS基因,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析。结果显示,GGPPS基因包含全长1 152 bp的开放读码框（ORF）,编码383个氨基酸,蛋白分子量为41.41 k D,等电点p I为5.84,是一个定位于叶绿体,不含跨膜结构域,不含信号肽的不稳定疏水蛋白。GGPPS氨基酸序列的主要二级结构为α-螺旋并含有一个类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟的GGPPS氨基酸序列与苹果、陆地棉和紫苜蓿等植物的GGPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析结果表明,香樟树GGPPS蛋白与无油樟GGPPS蛋白的亲缘关系相对较近。本研究成功克隆、分析并表达了香樟GGPPS,为进一步研究香樟GGPPS基因的功能,萜类合成调控机制等奠定了分子基础。