小尾寒羊GHR和GHRHR基因多态性与生长性状的关联分析

为了解小尾寒羊的生长和发育的遗传机制,为小尾寒羊的品种选育做基础,本研究对GHR和GHRHR基因的多态性进行检测,并将其多态性与生长性状进行了关联分析。试验利用PCR-SSCP技术,检测GHR和GHRHR基因在小尾寒羊群体的多态性,利用SPSS软件分析GHRH基因的多态性与生长性状之间的关联性。结果表明,在小尾寒羊群体中检测到3种GHR和GHRHR基因基因型,即DD、II、ID,GHR基因和GHRHR基因中II的基因型频率分别为0.6250、0.6875,ID的基因型频率分别为0.3130、0.2500,DD的基因型频率为0.0630、0.0625。GHR基因个体中DD基因型个体和ID基因型个体在宰后胴体质量、臀端高、尻长、颈长、胸深这5个性状中均表现出显著差异(P<0.05);DD基因型个体和Ⅱ基因型个体在宰前活体质量、宰后胴体质量、臀端高、尻长、颈长这5个性状中均表现出显著差异(P<0.05)。GHRHR基因中,DD基因型个体和ID基因型个体在宰前活体质量、宰后胴体质量、体高、体长、尻高、颈长、腰角宽、腿臀围这8个性状中均表现出显著差异(P<0.05);ID基因型个体与II基因型个体在颈长和羊的宰前活体质量这2个性状中表现出显著差异(P<0.05);同样DD基因型个体同II基因型个体在尻高、腿臀围这2个性状中均表现出显著差异(P<0.05)。结果证明,GHR和GHRHR基因与小尾寒羊生长发育的相关性,可作为本土小尾寒羊遗传杂交改良的重要功能候选基因。本研究为进一步研究小尾寒羊的遗传特性试验提供了理论依据,对于研究小尾寒羊的遗传多样性改良和培育优良小尾寒羊品种具有重要意义。

牛GHRHR基因的生物信息学分析

试验利用生物信息学方法对牛GHRHR基因的开放阅读框、理化性质、亲水性/疏水性、蛋白质二级结构、磷酸化位点/N-糖基化位点及跨膜区进行预测分析。结果表明:牛GHRHR基因编码441个氨基酸,等电点6.37,不稳定指数47.74,为不稳定蛋白;亲疏水平均值0.375,属于疏水蛋白;二级结构以无规则卷曲为主,含有112α螺旋、133个延伸链、196个无规则卷曲,33个潜在的磷酸化位点,有2个N-糖基化位点。

小尾寒羊GHR、GHRH、GHRHR基因多态性与肉质性状的关联分析

主要分析GHR、GHRH、GHRHR基因的多态性,以及其与小尾寒羊肉质性状的关联,以期为优质绵羊新品种培育提供一定的参考依据。采用PCR技术,检测小尾寒羊群体中GHR、GHRH和GHRHR基因的多态性,利用SPSS软件分析以上3种基因的不同基因型与肉质性状的关联性。结果表明,GHR与GHRHR共有3种基因型,分别为II、ID、DD,而GHRH基因仅检测到2种基因型,分别为II、DD。GHR基因中II基因型频率最高,为0.625,ID的基因型频率为0.313,DD的基因型频率最低,为0.063;多态信息含量(PIC)为0.283,处于中度多态性(0.25≤PIC<0.50);小尾寒羊GHR基因的DD基因型肉质的色泽显著低于ID、II基因型(P<0.05)。GHRHR基因中II基因型频率最高,为0.687 5,DD基因型频率最低,为0.062 5,ID基因型频率为0.2500;多态信息含量为0.258,处于中度多态性(0.25≤PIC<0.50);GHRHR基因的DD基因型的剪切力显著高于ID、II基因型(P<0.05)。GHRH基因中DD基因型频率最低,为0.437 5,II基因型频率最高,为0.562 5;多态信息含量(PIC)为0.371,处于中度多态性(0.25≤PIC<0.50);GHRH不同基因型对于小尾寒羊的所有肉质性状影响不显著(P>0.05)。综上所述,GHR基因、GHRHR基因可以作为小尾寒羊提升肉质品质的候选基因之一。

家鸡生长激素释放激素受体(GHRHR)的蛋白表达与抗体制备

本研究采用RT-PCR等方法,构建编码家鸡两个GHRH受体(GHRHR1和GHRHR2)N-末端胞外结构域的原核表达载体,并在细菌中成功诱导其表达.利用离子亲和层析技术,纯化两受体的重组蛋白片段.在此基础上,利用重组蛋白在兔中制备了两受体的抗体,采用Western blot方法,初步验证这些抗体对垂体以及HEK293细胞中表达的家鸡GHRHR1和GHRHR2识别的有效性.

藏鸡GHRHR-v1基因克隆及组织表达谱研究

为分析生长激素释放激素受体剪接突变体(GHRHR-v1)基因结构及在各个组织中表达水平在藏鸡生长发育中的特性,以150日龄藏鸡为研究对象,利用RT-PCR技术克隆藏鸡GHRHR-v1基因并进行序列测定,采用q PCR技术检测GHRHR-v1基因在藏鸡不同组织中的表达水平,从而构建该基因的组织表达谱。结果表明:GHRHR-v1基因序列长度为1 279 bp,其中开放阅读框长度为1 260 bp,编码419个氨基酸,藏鸡与鸡GHRHR-v1基因(登录号为DQ230840)核苷酸的同源性为99.76%,预测的氨基酸序列同源性为100%,两者亲缘关系最近。组织表达谱结果表明,GHRHR-v1基因在藏鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌、腿肌、下丘脑和垂体中均有表达,在垂体中表达水平最高,高表达组织为心脏、肝脏、脾脏和肺脏,低表达组织为肾脏、胸肌、腿肌和下丘脑,说明GHRHR-v1基因的表达主要集中于垂体。该结果为进一步研究藏鸡下丘脑-垂体生长轴上相关候选基因对生长发育的调控及藏鸡的选育提供一定的理论依据。

泸宁鸡和白羽肉鸡GHRHR基因克隆及mRNA表达模式的研究

为研究生长激素释放激素受体(GHRHR)基因在泸宁鸡和罗斯白羽肉鸡各个组织中的表达分布特性,采用RT-PCR技术获取42日龄两个鸡种GHRHR基因序列,并进行序列分析;通过qPCR技术检测GHRHR基因在下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌以及腿肌9个组织中的表达情况,并构建表达谱进行分析。结果表明:泸宁鸡和罗斯白羽肉鸡的GHRHR基因序列均长为1 279 bp,包括长为1 260 bp的CDs区,编码419个氨基酸;与原鸡和藏鸡具有较近的亲缘性;与原鸡相比,均存在碱基差异,其中泸宁鸡中1处碱基突变致使氨基酸发生改变。GHRHR基因主要在垂体组织中表达,在其他组织中极少表达或基本不表达。同时发现该基因的表达不存在性别差异,但存在物种差异。研究为进一步了解GHRHR基因的功能及物种多样性提供了一定的理论基础。

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。

GHRHR基因在湘西黄牛不同组织中表达差异性研究

本研究旨在比较分析GHRHR (Growth Hormone-Releasing Hormone Receptor)基因在湘西黄牛不同月龄及组织间的相对表达差异性。试验选取湖南德农牧业集团有限公司国家级保种场不同月龄(6、 18、 30月龄)湘西黄牛各8头,分别提取肝脏、背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪的总RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测GHRHR基因在湘西黄牛不同月龄的肝脏、背最长肌、皮下和腹腔脂肪mRNA的相对表达量。结果表明:(1) GHRHR基因在18月龄湘西黄牛肝脏、背最长肌、皮下和腹腔脂肪的4个组织中mRNA的相对表达量极显著高于6月龄和30月龄4个组织中的表达量(P<0.01)。(2)在6月龄时,GHRHR基因在湘西黄牛4个组织中m RNA的相对表达量差异不显著(P>0.05);在18月龄时,皮下脂肪和背最长肌GHRHR基因的表达量显著高于肝脏(P<0.05);在30月龄时,GHRHR基因在4个组织中的表达量大小关系为皮下脂肪>背最长肌>腹腔脂肪>肝脏,且两两之间差异显著(P<0.05)。由此可见,GHRHR基因在湘西黄牛脂肪代谢关键部位均有表达,且随月龄与组织的不同表达也不相同,存在着月龄和组织间差异性。

野牦牛与其他牛科动物GHRHR基因部分序列的比较

对野牦牛生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段(包括部分外显子6和部分内含子6)进行PCR扩增、克隆和序列测定,序列已提交到GenBank中(GenBank Accession No:EU872256)。利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9等生物信息学软件对野牦牛该基因序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛、绵羊等牛科动物相应序列进行比对分析。结果表明:野牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、绵羊4个物种基因序列间同源性大小依次为99.0%、98.3%、97.8%、92.0%,5个物种间共发现42处序列间碱基差异(9.84/100 bp),其中野牦牛与普通牛、瘤牛、水牛、绵羊4个牛科物种均存在差异碱基3处;推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为94.4%、94.4%、100.0%、94.4%。

miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics(miR-93-mi组)、mimics对照品(NC对照组)、inhibitor(miR-93-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体(GHRHR)的3′UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组(P<0.01);miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组(P<0.01),而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组(P<0.05)。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。

cGHRH_(1-27NH2)可作为家鸡生长激素释放激素受体的配体

家鸡生长激素释放激素(GHRH)的成熟肽段区存在一个酰胺化位点,提示具27个氨基酸残基的羧基端酰胺化多肽(cGHRH_(1-27NH2))可作为家鸡生长激素释放激素受体(GHRHR)的配体.为验证该假说,利用pGL3-CRE报告基因系统,在培养的中国仓鼠卵巢细胞中,探究人工合成cGHRH_(1-27NH2)多肽对家鸡两个GHRH受体的激活潜能.结果显示:cGHRH_(1-27NH2)可高效激活家鸡两个GHRH受体,并且该多肽对GHRH一型受体(cGHRHR_1:EC_(50):0.18 nmol/L)的激活效能略高于其对GHRH二型受体(cGHRHR_2:EC_(50):0.32 nmol/L)的激活效能.这些研究结果清楚表明GHRH_(1-27NH2)可作为家鸡两个GHRH受体的配体.