一步法微滴数字PCR检测生菜中GII型诺如病毒

目的:采用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)技术和QX200 Droplet Digital PCR System,建立一步法RT-ddPCR高灵敏快速检测生菜中GII型诺如病毒(norovirus genegroup II,NoV GII)的方法。方法:优化RT-ddPCR检测NoV GII的反应体系;通过10倍梯度稀释的NoV GII线性阳性质粒确定RT-ddPCR的检测范围;利用其他常见的肠道病毒核酸(非GII型诺如病毒)作为反应模板,与NoV GII核酸同时进行RT-ddPCR,判定反应体系的特异性,并通过不同时间多次检测样品的方式判断该检测方法的稳定性。采用ISO/TS 15216-1:2013食品中诺如病毒RNA提取方法,对人工染毒不同水平(高、中、低)的NoVGII生菜样品进行检测,同时研究去除抑制物前后对RT-ddPCR检测的影响,并与逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)进行检测回收率的对比,探究RT-ddPCR在食品中NoV GII快速与定量检测上的发展潜力与应用前景。结果:RT-ddPCR的最高检测限为8.47×104 copies/μL,最低检测限为2.12 copies/μL,RT-ddPCR扩增效率为95.44%,标准曲线相关系数为0.997 3。在不同浓度人工染毒生菜样品中,抑制物的存在对ddPCR回收率检测结果没有显著性差异。在高、中染毒浓度下,抑制物对RT-qPCR与RT-ddPCR回收率检测结果影响不显著。低浓度下,未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率仅1.43%,与去除抑制物后的RT-qPCR检测结果(平均回收率为9.71%)有显著差异,且与RT-ddPCR的检测结果(未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率为11.80%,去除抑制物后平均回收率为12.53%)存在显著性差异。结论:生菜抑制物对RT-ddPCR的检测影响不显著,利用RT-ddPCR可有效测出低浓度的受污染样品,避免用现有的RT-qPCR方法因抑制物带来的"假阴性"检测结果。本实验建立的RT-ddPCR方法能高效、灵敏地检测出受污染食品中NoV GII的低病毒含量,在食源性病毒检测中具有可观的发展潜力和应用前景。

基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增技术检测GII型诺如病毒基因

建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification,RT-LAMP)方法应用于GII型诺如病毒基因检测。针对诺如病毒RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白基因序列(RNA-dependant RNA polymerase and capsid protein gene)设计出6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行扩增反应60min。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,以其颜色变化作为结果判断标准,并经琼脂糖凝胶电泳验证。本文利用此技术对不同腹泻病毒进行了特异性分析,对体外转录的GII型诺如病毒RNA的梯度稀释进行了灵敏度分析,同时与逆转录PCR(RT-PCR)方法进行比较,并对93份腹泻患者粪便中的病毒核酸进行了检测。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,灵敏度达到1 000拷贝/μLRNA分子水平,与常规检测RT-PCR方法相当。对临床标本的阳性检出率也与常规RT-PCR相当。由于此方法特异性强,灵敏度较高,耗时短,结果直观,因此有望用于GII型诺如病毒的现场快速检测。

常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的建立及其应用

目的建立GI、GII型诺如病毒的常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法,并对两种方法进行应用。方法优化筛选出最佳PCR反应体系与反应条件,并从灵敏性、特异性、临床样品检测等方面对建立的方法进行比较与评价。结果该两种方法特异性强,与札幌病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应,同一体系内GI、GII型诺如病毒相互之间没有干扰;常规RT-PCR最低检测限为103copies/μL,荧光定量RT-PCR最低检测限为102copies/μL;对180份临床粪便样品进行检测,常规RT-PCR则检测率为5.56%(10/180),符合率达97.22%,荧光定量RT-PCR检测率为8.33%(15/180),符合率达100%;对15份阳性样品测序分析,证实均为诺如病毒。结论建立的常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可用于诺如病毒的快速检测,荧光定量RT-PCR更为灵敏。