我国GII.4型诺如病毒Sydney株P颗粒的表达及其组织血型抗原结合特征

目的表达我国新发现GII.4型诺如病毒优势流行株—Sydney株的P颗粒,并探究其结合人类组织血型抗原(HBGAs)受体特征及变化规律。方法扩增SH 2012_05株中的P区域序列,构建进化树分析其氨基酸序列,并在原核表达系统中表达P颗粒。目的重组蛋白经Western blot确定其特异性,并采用ELISA法检测P颗粒结合HBGAs的能力及方式。结果 SH 2012_05毒株P区域与Sydney/2012原型株同源性为99.1%,为GII.4/Sydney基因簇。SDS-PAGE电泳和Western blot分析验证SH 2012_05株P颗粒具有特异性。其结合HBGAs受体方式与以往流行的基因簇一致,即与A、B、O、AB型分泌型唾液均能结合,其中与B型抗原亲和力最高。结论成功表达了我国新发现GII.4型诺如病毒Sydney株的P颗粒,明确了Sydney株能结合分泌型HBGAs受体的特征。本研究为诺如病毒疫苗株选择提供了技术储备,这将为GII.4型诺如病毒的预防和控制提供科学基础。

诺如病毒新型GII.4流行株Sydney_2012在上海地区的检出和鉴定

为了解上海地区诺如病毒相关急性胃肠炎疫情的流行病学特点及流行株基因型的演化情况，2012年3月至2013年2月，收集上海市两处哨点医院成人急性胃肠炎粪便样本进行诺如病毒的分子检测并对其基因特征进行系统分析。在502份样本中，GI群共检出19例，检出率3．78％，呈现低位流行、全年散发的状态，无明显的季节分布；GII群检出86例，检出率17．13％，在10～12月出现高位流行，并发现中老年人群GII群诺如病毒检出率显著高于青年个体（Pd0．05）。同时首次于2012年9月在上海地区检出新型GII．4变异株Sydney-2012，证实是该变异株引发了2012年秋冬季诺如病毒急性胃肠炎的高位流行。序列分析表明该变异株为GII．e型开放阅读框（Openreadingframe，ORF）1与GII．4型ORF2的重组体，目前已成为本地区的优势流行株。研究发现，2012年上海地区出现GII．4新型变异株Sydney_2012，并引发秋冬季诺如病毒急性胃肠炎的高位流行。

诺如病毒GII.4型济南JN010株基因组特征分析

目的分析诺如病毒(Novirus, NoV)GII.4型济南JN010株基因组序列及其特征。方法根据文献并结合PrimerSelect软件设计7对引物,利用RT-PCR方法获得NoV济南JN010株全基因组序列,应用Lasergene7.1、MEGA5.2等软件对基因组序列进行遗传进化、同源比对分析,建立ORF1及ORF2基因系统进化树。并根据VP1氨基酸序列进行突变分析。结果NoV JN010株基因组序列全长7 516 bp,为GII.Pe/GII.4基因型,属于GII.4 Sydney 2012变异株。突变位点主要发生在VP1的P2区,其中抗原表位A及与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)结合位点A处发生R297H突变,毗邻抗原表位A位点发生I293N和H373N突变。根据ORF1基因序列,JN010株与日本Osaka源病毒株(GenBank登录号LC066046)亲缘关系较近;根据ORF2基因序列,与广东中山源病毒株(GenBank登录号KY407064)亲缘关系较近。结论NoV JN010株VP1在抗原表位A及与HBGAs结合位点发生突变,可能影响其抗原性及与HBGAs结合的特异性。

基于GII.4型诺如病毒P蛋白的GII型广谱单克隆抗体制备及应用

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是全球引起急性胃肠炎的重要传染病原。该病毒遗传多样性丰富,包括了5个基因群以及39种基因型,免疫学检测受限。因此,本研究旨在制备广谱性的HuNoV单克隆抗体,并建立可检测多种基因型的双抗体夹心ELISA方法。本研究通过表达纯化流行毒株GII.4型HuNoVs衣壳蛋白P颗粒免疫Balb/c小鼠,筛选出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体并进行评价。利用辣根过氧化物酶对抗体进行标记及配对筛选,建立了HuNoVs双抗夹心ELISA检测方法,并进行验证。结果显示:B10、1D6、1C1细胞株可分泌广谱性单克隆抗体。所建立的双抗夹心ELISA方法酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000,捕获抗体最佳包被浓度为2.0μg/mL,该方法检测GII.4型P颗粒最低检出限为125.0ng/mL,对常见HuNoVs GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.17基因型样本均能检出,而与轮状病毒、星状病毒、肠道病毒、札幌病毒无交叉反应。批间与批内重复变异系数均小于7%。临床样本检测结果显示,本方法与荧光定量RT-PCR结果的符合率为84%。本研究成功制备了广谱性的HuNoVs衣壳蛋白单克隆抗体,建立了可应用于HuNoVs流行毒株基因型的双抗夹心ELISA检测方法,为HuNoVs的诊断及流行病学调查提供了一种简便、特异的免疫学方法。

GII-4型诺如病毒ORF2基因克隆及序列分析

目的获得中国流行株GII-4型诺如病毒（NoV）ORF2基因序列,为进一步研究诊断、疫苗提供基础依据。方法从GII-4型NoV粪便中提取病毒RNA,经逆转录后PCR并克隆到simple PMD18-T载体获得完整开放读码柜架（ORF2）阅读框序列。结果获得了正确序列的基因II-4,亚型（genogroup II-4,GII-4）NOV ORF2基因序列,经软件分析,3株NOV ORF2序列编码的氨基酸大小约为54KD,与VA387（GII-4）氨基酸同源性为92%-93%。ORF2编码的氨基酸序列存在3个相对保守序列。结论获得GII-4型NoV ORF2基因序列,为进一步表达病毒衣壳蛋白及Nov感染的诊断试剂及防治疫苗药物研制提供基础依据。

诺如病毒GⅡ.4型密码子偏爱性及聚类分析

[目的]分析诺如病毒GⅡ.4基因型密码子的偏爱性变化,探索其聚类情况。[方法]从NCBI上下载GⅡ.4型所有完整毒株,使用CodonW、EMBOSS、SigmaPlot14.0软件对诺如病毒GⅡ.4型密码子偏爱性进行分析,使用SPSS软件对GⅡ.4型聚类分析。[结果]诺如病毒GⅡ.4型三种编码框的ENC值均>50;RSCU>1的密码子以U/C结尾的居多;ENC-Plot显示GⅡ.4型三种编码框绝大多数位于标准曲线之下;PR2分析中,GⅡ.4型三种编码框四个象限分布不均匀;GⅡ.4型按照年份的聚类分析显示不同年份之间存在着一定程度的聚类。[结论]诺如病毒GⅡ.4型三种编码框的偏爱性较弱,密码子使用以U/C结尾为主,其使用偏倚受到突变和自然选择,但以自然选择为主,近年来存在着聚类情况。

诺如病毒GⅡ.4 IgG抗体的荧光素酶免疫吸附方法的建立及在动物血清中的应用

诺如病毒(Norovirus,NoV)是引起全球范围内人类急性胃肠炎(Acutegastroenteritis,AGE)的主要病原体,对全球健康和经济造成了重大威胁。已有研究在不同种类的动物粪便中检出人类诺如病毒(Human norovirus,HuNoV)的核酸或在家畜血清中检测出可识别HuNoV病毒样颗粒(Virus like particles,VLP)的抗体,这引起了公众对NoV是否为潜在人兽共患病的关注与讨论。本研究基于HuNoV主要流行株GⅡ.4建立了一种检测GⅡ.4IgG的荧光素酶免疫吸附试验(Luciferase immunosorbent assay,LISA)。LISA法具有较高的灵敏度(94.87%)和特异度(98.18%);最低检测限是ELISA法的2~16倍;GⅡ.4-LISA检测人血清的批间和批内变异系数值均小于10%,重复性良好。GⅡ.4 IgG在狗、猪、蝙蝠、大鼠和鼩鼱等不同的家畜和野生动物中均有检出,阳性率在3.37%~39.53%之间,其中蝙蝠的检出率最高(39.53%),狗次之(9.72%)。综上所述,本研究建立的GⅡ.4-LISA方法适用于人和不同种属动物中GⅡ.4特异性IgG检测。针对HuNoV的IgG抗体广泛分布,提示NoV可能是潜在的人畜共患病。

诺如病毒GⅡ.4型流行株基因序列分析和流行病学研究

目的研究诺如病毒的基因特征和变化规律,预测诺如病毒的进化方向及流行趋势,为预防诺如病毒病的暴发打下良好基础。方法采用RNA提取试剂Trizol提取诺如病毒毒株RNA,采用试剂盒TaKaRa Ex TAP进行PCR扩增,利用Bioedit软件对基因序列进行拼接,然后对基因序列分析。将PCR扩增出的P区域克隆到表达载体,构建原核表达质粒。在大肠埃希菌中表达P蛋白,重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测。以ABO血型健康人唾液为受体研究P粒子与唾液HBGA结合能力,检测方法采用间接ELISA法。结果实验用诺如病毒毒株与GⅡ.4流行株在RdRp区的核苷酸序列同源性达到94%以上,其中US95/96株94%,Farmington Hills株94.2%,Hunter株94.7%,DenHaag2006b株95.8%,Osaka2007株96.5%,NewOrleans2009株97.2%,Sydney2012株98.4%。实验株与GⅡ.4流行株在衣壳蛋白区的核苷酸序列同源性达到94%以上,其中US95/96株94.3%,Farmington Hills株94.1%,Hunter株95.2%,DenHaag2006b株96.3%,Osaka2007株96.8%,NewOrleans2009株97.8%,Sydney2012株98.6%；氨基酸同源性达到96%以上,其中US95/96株为96.1%,Farmington Hills株96.3%,Hunter株97.1%,DenHaag2006b株96.8%,Osaka2007株97.3%,NewOrleans2009株97.8%,Sydney2012株98.9%。实验株在RdRp区核糖核苷酸序列的与Neworleans2009和Sydney2012同源性较高,实验株中P2区氨基酸位点发生多点位定向突变,如P2区第95位由天冬酰胺（N）突变为组氨酸（H）。重组蛋白经SDS-PAGE凝胶分离检测产物大小为35ku的目的蛋白表达。检测P粒子与唾液HBGA结合能力（A450值）血型A为3.815.12；血型B为3.124.05；血型O为2.853.51。结论诺如病毒在遗传上具有多样性,变异快的特点,因而很难有疫苗对它长期安全有效。通过对GII.4型基因序列的研究,有助于寻找其关键位点变化规律和流行株进化机理,有助于预测诺如病毒的进化方向及流行趋势。

GⅡ.4型诺如病毒的进化及疫苗研究进展

人诺如病毒（Noroviruses,No Vs）是杯状病毒科（Caliciviridae）的一种单链正股RNA病毒,是引起急性胃肠炎的主要病因,以GⅡ.4基因型最为流行.GⅡ.4型诺如病毒极易发生变异,每隔2~3年便可形成新的变异株,引起胃肠炎大范围流行,这与甲型流感病毒的流行特点相似.GⅡ.4型诺如病毒的进化机制涉及受体-组织血型抗原（HBGAs）、基因组空间、群体免疫、复制保真度等因素,这些因素共同影响GⅡ.4型的进化率.诺如病毒变异较快,使得诺如病毒疫苗的研发较为困难.但令人欣慰的是,目前基于GⅡ.4病毒样颗粒（VLPs）的疫苗研制进展顺利,有望在短期内面世;此外,诺如病毒体外感染模型的建立,使得减毒活疫苗与灭活疫苗的研发成为可能.

基因序列比对法验证实时荧光定量PCR阳性结果真伪

实时荧光定量PCR(q PCR)是检测食源性病毒的常用方法,其高度的灵敏性导致检测过程中容易产生假阳性结果。基因序列比对法是比利时根特大学食品微生物与食品保藏实验室新近建立的验证q PCR阳性结果真伪的一种方法。本研究以检测贝类诺如病毒GII.4(No V GII.4)为例,采用基因序列比对法验证q PCR阳性结果的真伪。在q PCR检测时添加102copies/m L的No V GII.4质粒作为标准阳性对照,旨在排除由于q PCR的高灵敏性而产生的假阳性结果。研究结果表明,在8份No V阳性的贝类样品中,2份为No V GII.4真阳性,2份可能为No V GII.4的变异株,1份为受到质粒污染的假阳性,其余3份为引物二聚体所致假阳性。基因序列比对法作为一种验证q PCR阳性结果真伪的高效、可行的方法,值得推广。

长沙地区诺如病毒基因型分析

目的确定长沙地区引起急性胃肠炎诺如病毒的类型。方法从128例腹泻患者粪便中,提取RNA。将RNA进行逆转录、扩增、测序,并通过构建基因进化树进行分析导致长沙地区患者感染的诺如病毒的主要种类。结果63个样品中含有诺如病毒,分别为GII-3、GII-4、GII-12三种类型,其中GII-4为主要病原体。结论在长沙地区,诺如病毒GII-4是引起病毒性胃肠炎的的主要致病株。GII-4基因进化快速,已成为全球范围内导致急性胃肠炎的最常见病毒株。