GIRK2通道外流门控机制的分子动力学模拟

为深入理解外流调控型病理或药效机制,采用全原子分子动力学模拟方法,在外向电场作用下,对不同因子(Na+、Gβγ、Na+-Gβγ)调控下的GIRK2通道进行微秒级分子动力学模拟,揭示GIRK2通道的外向电流门控机制。结果表明:Na+和Gβγ亚基协同作用激活GIRK2通道,Na+使得GIRK2通道G-loop门控打开概率高达94.6%,显示出G-loop门控的调节作用;Gβγ主要影响HBC门控,使其打开概率为73.6%。CTD结构域内向摆动约148.8°和TM2-CTD逆向旋转约11.9°可导致G-loop门激活,而CTD外向摆动和TM2外向倾斜约38.3°导致HBC门激活。

右美托咪定鞘内注射对大鼠急性疼痛行为及脊髓GIRK2表达的影响

目的观察鞘内注射右美托咪定(Dex)对切口痛模型大鼠诱发疼痛及脊髓背角GIRK2表达的影响。方法采用大鼠切口痛模型。健康成年雄性SD大鼠60只,随机分为对照组(I组,不作任何处理)、手术组(S组,行左足底切开手术)、安慰剂组(P组,先鞘内注射生理盐水后行左足切开手术)、实验1组(L组,先鞘内注射Dex 0.75μg/kg后行左足切开手术)和实验2组(H组,先鞘内注射Dex 1.5μg/kg后行左足切开手术)。使用vonfrey细丝法观察不同时间点大鼠机械痛阈的改变,免疫荧光技术检测脊髓背角GIRK2蛋白表达的变化。结果L、H组机械痛阈值较S组及P组明显升高(P<0.05);大鼠脊髓背角GIRK2蛋白表达也明显增多(P<0.01)。L组与H组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论鞘内预先给予Dex能减轻大鼠急性创伤后的疼痛阈值,增加大鼠脊髓内GIRK2表达,提示DEX的镇痛作用可能与通过上调GIRK2蛋白表达有关。

GIRK4基因在肥胖大鼠肾脏组织的表达

目的研究GIRK4基因在正常与肥胖大鼠肾脏组织表达水平的差异。方法采用饮食诱导的方法构建肥胖大鼠模型,Western blot技术对正常组与肥胖组大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达进行定量分析。结果肥胖组大鼠肾脏组织GIRK4蛋白相对表达量为1.75±0.42,明显低于正常组大鼠的3.37±0.68(P<0.05)。结论肥胖大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达降低。

GIRK4在肥胖大鼠模型心肺组织中的表达研究

目的研究饮食诱导肥胖大鼠G-蛋白偶联(门控)内向整流钾离子通(GIRK4)基因在心肺组织中的表达,探讨GIRK4与肥胖的相关性。方法 30只SD大鼠,雌雄各半,10对照组(n=10),予以普通饲料饲喂作为,实验组(n=20),以高脂肪高热量饮食饲喂8周,建立肥胖大鼠模型,肥胖大鼠体重超过正常饮食饲喂大鼠20%以上为成功模型,处死大鼠,提取两组大鼠的心肺组织,分别提取心肺的总蛋白,应用Western blot检测技术,检测GIRK4蛋白表达,Quantity One软件处理实验结果。结果①15只大鼠进入肥胖组(体重大于正常对照组20%);②肥胖组血清总胆固醇及甘油三酯水平高于对照组(P<0.05),高脂高糖饮饲喂建立大鼠模型,肥胖大鼠心、肺中表达GIRK4蛋白较正常饲喂大鼠低,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论GIRK4在大鼠心、肺均有表达,可能与肥胖时心律失常及肺损伤相关。

钾通道GIRK4中G蛋白βγ亚基结合区的研究

G蛋白激活的内向整流型钾通道 (GIRK)在调节心肌房室细胞和神经元的兴奋性中具有重要作用。为了深入阐明G蛋白βγ亚基激活钾通道的分子机制 ,运用系统缺失突变和重组蛋白体外结合方法 ,研究GIRK4分子中能够与G蛋白βγ亚基结合的区域。结果表明 ,GIRK4N端膜内域中的 4 192区和C端膜内域中的 2 5 334 8区分别是G蛋白βγ亚基的最小结合区域。这一研究为进一步确定Gβγ激活GIRK通道的调节位点 。

蛋白质印迹法检测GIRK4在SD大鼠肾脏组织的表达

目的探讨GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织的表达水平。方法采用蛋白质印迹法(Western-blot-ting)对健康SD大鼠肾脏组织GIRK4蛋白表达进行定量分析。结果 GIRK4基因蛋白在健康SD大鼠肾脏组织相对表达量为3.37±0.68。结论从蛋白质水平对GIRK4基因在健康SD大鼠肾脏组织表达的定量研究,将为探索GIRK4基因与肾脏生理功能及其相关临床疾病的关系奠定基础。

记忆障碍大鼠GIRK1和IRK1的表达

目的 研究大鼠侧脑室注射聚集态 β淀粉样肽2 5 - 35 (β AP2 5 - 35 )后不同时间 ,大脑皮层GIRK1和IRK1的表达。方法 通过Morris水迷宫实验测量大鼠空间学习记忆能力 ;用RT PCR方法测定GIRK1和IRK1的相对表达水平。结果 在Morris水迷宫实验中 ,第 4,5 ,8及 10次训练时 ,β AP注射组的潜伏期比假手术组明显延长。β AP注射后 1d及 3d组和假手术组相比 ,GIRK1的表达明显降低 ,17d后与假手术组相同。IRK1的表达无明显改变。结论 大鼠侧脑室注射聚集态 β AP2 5 - 35 可引起空间学习记忆能力和钾通道表达改变。

GIRK4错义突变与新疆和田地区维吾尔族人群代谢综合征相关性研究

目的新疆维吾尔族人群代谢综合征(MetS)罹患率高,本研究在前期基础上探讨G-蛋白偶联内向整流钾通道4(GIRK4)基因低频率错义突变610G>A(Met210Ile)在和田维吾尔族人群的发生率及分布特点,明确该错义突变是否与维吾尔族代谢综合征有关。方法应用Taq Man-PCR技术在新疆和田维吾尔族自然人群中对外显子2区630G>A,Met210Ile错义突变进行基因分型。结果该位点仅有GG和GA两种基因型;最小等位基因频率<0.005(为0.0028);发生突变的7例个体均为腹型肥胖患者。对突变序列保守性分析显示,该位点中度保守。结论 GIRK4基因630G>A(Met210Ile)错义突变可能与新疆维吾尔族人代谢综合征不相关性,但可能与超重与腹型肥胖有关。因其发生频率低,有待于进一步行功能试验验证。

CLC-3与GIRK1基因在宫颈癌中的表达及临床意义

目的:探讨容量调控性氯离子通道(CLC-3)与内向整流型钾离子通道(GIRK1)在宫颈癌中的表达及临床意义。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测60例宫颈癌组织,10例经放化疗前后的宫颈癌组织,10例正常宫颈组织中的CLC-3 mRNA与GIRK1 mRNA的表达。结果:CLC-3 mRNA在正常宫颈组织中与宫颈癌组织中的灰度值的比值为0.691 2及2.393 7,差异有统计学意义(P<0.01)。CLC-3mRNA在高分化癌、中分化癌及低分化癌中的表达分别为1.318 7、1.571 8及4.589 9,差异有统计学意义(P<0.01)。CLC-3 mRNA在宫颈癌Ⅰ-Ⅱ期中表达为1.084 2,在宫颈癌Ⅲ-Ⅳ期表达为3.568 8,差异有统计学意义(P<0.01)。CLC-3基因在放化疗前的宫颈癌组织中表达为1.519 8与放化疗后的0.223 7相比,有显著性差异(P<0.01)。GIRK1 mRNA在正常宫颈组织中与宫颈癌组织中的灰度值的比值为0.025 2及1.547 2,差异有统计学意义(P<0.01)。在高分化癌、中分化癌及低分化癌中的表达分别为0.985 5、0.856 4及1.862 7,差异有统计学意义(P<0.05)。GIRK1 mRNA在宫颈癌Ⅰ-Ⅱ期中表达为0.989 6,在宫颈癌Ⅲ-Ⅳ期表达为1.974 2,差异有统计学意义(P<0.01),GIRK1 mRNA在放化疗前的宫颈癌组织中表达为1.371 0与放化疗后的0.293 9相比,有显著性差异(P<0.01)。结论:CLC-3及GIRK1基因在宫颈癌中高表达,与宫颈癌的不良预后有关。放化疗可降低CLC-3及GIRK1基因的表达,与疗效相关。

肥胖大鼠模型脑组织中GIRK4的表达研究

目的研究饮食诱导肥胖大鼠G-蛋白偶联(门控)内向整流钾离子通道(GIRK4)基因在脑组织中的表达,探讨GIRK4与肥胖的相关性。方法 30只SD大鼠,雌雄各半,对照组(n=10)予以普通饲料饲喂作为,实验组(n=20)以高脂肪高热量饮食饲喂8周,建立肥胖大鼠模型,肥胖大鼠体重超过正常饮食饲喂大鼠20%以上为成功模型,处死大鼠,提取两组大鼠的脑组织,提取脑组织中的总蛋白,应用Western blot法检测GIRK4蛋白表达,Quantity One软件处理实验结果。结果 (1)15只大鼠进入肥胖组(体重大于正常对照组20%)。(2)肥胖组血清总胆固醇及甘油三酯水平高于对照组(P<0.05),高脂高糖饮饲喂建立大鼠模型,肥胖大鼠脑中表达GIRK4蛋白较正常饲喂大鼠低,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GIRK4在肥胖大鼠脑组织中表达水平降低,且在肥胖大鼠中表达,可能与饮食诱导肥胖的发生相关。

FLAG标记的GIRK4通道的构建、表达及其对GIRK4功能的影响

目的在GIRK4通道蛋白中加入FLAG标记短肽,并检测通道功能是否受到影响。方法运用聚合酶链式反应(PCR)技术合成带有FLAG标记的GIRK4通道片段,并将该片段插入至载体pGEMHE质粒DNA中。使用免疫印迹检测FLAG短肽是否与GIRK4通道蛋白融合,并使用双电极电压钳(two-microelectrodevoltageclamp,TEVC)检测通道的表达情况。结果经测序鉴定,确认成功构建了重组质粒DNA即FLAG-GIRK4-pGEMHE,使用双电极电压钳检测有通道电流。结论通过PCR技术成功构建重组质粒DNA,即FLAG-GIRK4-pGEMHE,且FLAG标记蛋白已稳定表达并且未影响GIRK4通道蛋白的功能,为今后研究GIRK4通道蛋白功能提供了简便途径。

右美托咪定对大鼠急性疼痛行为及大脑皮质GIRK1表达的影响

目的观察静脉注射右美托咪定对切口痛模型大鼠急性疼痛行为及大脑皮质GIRK1蛋白表达的影响。方法采用大鼠切口痛模型。健康成年雄性SD大鼠72只,随机分为4组(n=18):C组不作任何处理,P组先静脉注射生理盐水后行左后足切开手术,LD组先静脉注射右美托咪定5μg/kg后行左后足切开手术,HD组先静脉注射右美托咪定10μg/kg后行左后足切开手术。于注射或术后0.5、1、2、4、6和24 h采用von frey细丝法测定大鼠左后足机械痛阈的改变。于注射或术后2、4 h每组取6只大鼠处死后取脑组织,分别采用免疫荧光标记法和Western blot法检测大脑皮质GIRK1蛋白的表达。结果与P组比较,LD、HD组大鼠机械痛阈值在术后4 h内明显升高(P<0.05),在6 h后比较差异无统计学意义(P>0.05);与P组比较,LD、HD组术后2、4 h时大脑皮质GIRK1蛋白表达上调(P<0.05),但LD组与HD组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论静脉预先给予右美托咪定能升高大鼠急性创伤后的疼痛阈值,增加大鼠大脑皮质GIRK1蛋白表达,提示右美托咪定的镇痛作用可能与上调GIRK1蛋白表达有关。

GIRK通道开放剂在癫痫大鼠中抗癫痫的研究

目的探讨GIRK通道开放剂氟吡汀(flupirtine)对癫痫大鼠癫痫发作和脑电图的影响。方法 30只雄性健康成年SD大鼠随机平均分成三组:正常对照组、癫痫+生理盐水(NS)组和癫痫+氟吡汀(flupirtine)组。癫痫+生理盐水(NS)组和癫痫+氟吡汀(flupirtine)组两组动物复制青霉素诱发癫痫模型,造模成功后分别给予生理盐水和氟吡汀治疗,再观察痫样行为和脑电图。结果正常对照组行为学和脑电图均正常;癫痫+生理盐水组有明显痫样行为,脑电图呈现明显的尖波、棘波、尖-慢复合波以及棘-慢复合波的阵发性痫样放电;癫痫+氟吡汀组大部分大鼠行为正常或是轻度的痫样行为,脑电图恢复正常的基础波放电,只有1例呈少量的痫样放电。结论 GIRK通道开放剂flupirtine对癫痫大鼠痫样行为和异常的脑电图有改善作用。

GIRK通道在匹罗卡品癫痫模型中的表达改变

目的:研究匹罗卡品诱导癫痫发作后不同时期G蛋白门控内向整流钾离子(GIRK)通道在大鼠海马神经元细胞膜表面表达变化情况,并探索可能的调控机制。方法:将成年雄性SD大鼠随机分为对照组和匹罗卡品造模组。利用致痫剂匹罗卡品诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE)后,分别在急性期(24 h)和慢性期(30 d)取海马组织提取膜蛋白,利用Western印迹方法检测海马膜蛋白GIRK通道亚基蛋白GIRK1、GIRK2的表达改变,并同时检测海马组织PI3K/Akt通路激活情况。建立细胞癫痫模型,观察PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002对海马神经元内向整流钾通道(Kir)电流的影响。结果:匹罗卡品诱导大鼠SE发作后,急性期细胞膜上GIRK1和GIRK2蛋白的表达较对照组相比显著下调(P<0.05)。海马膜蛋白中GIRK1的表达在大鼠SE发作后慢性期较对照组下降(P<0.05),而GIRK2蛋白表达量没有显著改变。p-Akt(308)与Akt蛋白表达量的比值在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期与对照组相比显著上升(P<0.05),而在SE发作后慢性期差异无统计学意义。在细胞癫痫模型中,渥曼青霉素和LY294002对痫样放电神经元的Kir电流未发现显著影响。结论:在匹罗卡品诱导大鼠SE发作后急性期,海马中GIRK通道蛋白表达量下调,PI3K/Akt通路存在明显激活。

GIRK4基因多态性与新疆南疆地区维吾尔族原发性高血压的关联研究

目的研究GIRK4基因多态性与新疆南疆地区维吾尔族人群原发性高血压的相关性。方法采取病例一对照研究方法，筛选1194名体重指数（body mass index，BMI）〉18．5kg／m。的人群，按高血压诊断标准，将收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg作为高血压组（482例），收缩压≤140mmHg和（或）舒张压≤90mmHg作为正常组（712人），其中男性461人，女性733人。提取两组血样的基因组DNA，PCR扩增GIRK4基因并测序。结果通过对GIRK4基因测序，在上述人群中发现171C／T（rs6590357）、5126A／G（rs4937391）、6262A／C（rs2604204）、-20559C／G（rs11221497）等4个多态位点，其基因型分布均符合Hard—Weinberg平衡（P〉0．05）。连锁不平衡分析显示，rs11221497位点与rs4937391、rs2604204、rs6590357位点之间位点存在连锁不平衡（D’〈0．001），后3个位点之间连锁平衡（D’〉0．9）；rs6590357、rs4937391、rs2604204等3个位点的基因型在高血压组和对照组间的频率分布差异无统计学意义（P〉0．05）；rs11221497位点CC基因型平均收缩压[（132．69±26．9）mmHg）]高于CG基因型[（127．4±22．7）mmHg]及GG基因型[（121．1±26．3）mmHg]；CC基因型舒张压[（79．4±15．6）mmHg]也高于CG基因型[（77．1±14．1）mmHg]和GG基因型[（72．9±14．8）mmHg]，其中CC型与GG型间平均收缩压及舒张压差异有统计学意义（P〈0．05）；基因频率分析显性模型显示rs11221497位点CC基因型在高血压组分布频率高于正常组，两组间比较差异有统计学意义[P〈0．05，OR-0．67（0．49～0．93）]；Logistic回归分析显示，在校正吸烟、年龄、BMI后，rs11221497位点与新疆维吾尔族肥胖人群高血压相关。单倍型分析发现,H6单倍型（C—G-C-G）在正常组中分布明显高于高血压组，差异有统计学意义（P〈0．05），是其保护性因子。结论GIRK4基因rs11221497位点可能和新疆维吾尔族肥胖人群高血压相关，等位基因G可能是其保护因素。

GIRK4基因多态性与新疆维吾尔族人胰岛素抵抗的相关性研究

目的探讨G蛋白偶联内向整流钾通道（G-protein-activated inwardly rectifyingK’channel，GIRK4）基因多态性与新疆维吾尔族人胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的相关性。方法采取横断面流行病学调查为基础的病例一对照研究，随机选取1295位（324例IR患者和971名对照）新疆维吾尔族研究对象，随机抽取其中48例IR患者测序筛查维吾尔族人GIRK4基因功能区的变异位点，然后选取代表性的变异位点，在1295名研究对象中基因分型并进行关联分析研究。结果年龄≤50岁维吾尔族人群中，rs11221497位点变异与IR相关（基因型模型P=0．017，显性模型中P=0．009），Logistic分析校正混杂因素（年龄、性别、吸烟、饮酒）后，显性模型CC基因型携带者患IR的0R值为1．833（95％CI：1．157～2．905）。结论GIRK4基因多态性可能与新疆维吾尔族人IR相关；rs11221497位点CC基因型是IR的危险因素。

GIRK4在肥胖大鼠脂肪组织中的表达

目的研究饮食诱导肥胖大鼠G蛋白耦联（门控）内向整流钾离子通道（GIRK4）基因在脂肪组织中的表达，探讨其与肥胖的相关性。方法30只Sprague—Dawley大鼠随机分为两组：对照组（n=10），予以普通饲料饲喂；肥胖组（n=20），予以高脂肪、高热量饮食饲喂。8周后处死大鼠，提取两组的白色脂肪组织和棕色脂肪组织，应用Western印迹技术检测GIRK4蛋白表达。并测定两组大鼠血糖、甘油三酯、血清总胆固醇水平。结果（1）共15只大鼠人组肥胖组（体重大于对照组大鼠平均体重20％）。（2）肥胖组血清总胆固醇及甘油三酯水平高于对照组（P〈0．05），但血糖在两组问差异没有统计学意义（P〉0．05）。（3）GIRK4在两组大鼠白色脂肪及棕色脂肪组织中均有表达，肥胖组的表达水平低于对照组（P〈0．05）。结论GIRK4可能肥胖的发生、发展中发挥一定作用。

weaver基因对CAD细胞生物学功能的影响

目的 :评估weaver基因对神经细胞生长发育、蛋白质表达和生命力的影响。方法 :将一类酪氨酸脱氢酶阳性的神经细胞 (一种中枢神经源细胞 ) ,又称CAD (Cath .a -differentiated ,是Cath .a细胞的一种突变型 ,Cath .a是一种转基因大鼠的肿瘤细胞 )细胞 ,引入由DNA编码的野生型和突变型离子通道。采用DNA克隆、免疫组化、Westernblot等技术进行检测。用不同浓度 (0 2 5mg/L ,0 5mg/L ,1 0mg/L)的Girk2cDNA(对照组 )和wvGirk2cDNA(实验组 )质粒转染CAD细胞后 ,观察两组基因对转染CAD细胞的数目、蛋白质合成、神经突生长等指标的影响 ;并且观察MK80 1和Kir2 3对wvGirk2的抑制作用。结果 :发现高浓度wvGirk2转染的CAD细胞存活数目减少到约6 0 %的单纯Girk2转染细胞数目 ;低浓度wvGirk2没有引起细胞死亡但是减少转染基因的蛋白质产物 ,且神经轴突生长也受wvGirk2影响 ;MK80 1和Kir2 3对wvGirk2有抑制作用。结论 :wvGirk2基因在weaver动物中有一种特殊功能 ,可阻断wvGirk2通道防止细胞死亡。

G蛋白门控的内向整流钾通道在中枢神经系统中的调控机制及功能研究进展

钾离子（K＋）通道是细胞膜上种类最多,分布最广的一类特殊的蛋白质微孔道。在兴奋性细胞中,它们与细胞体积调节、细胞激素分泌、细胞膜电位的形成以及电脉冲的产生都有着密切的关系。所有的K＋通道都有一个保守的选择性过滤器,允许K＋通过,而不允许Na＋通过。K＋流依电化学梯度的方向,通过孔道被动地流入或流出细胞。