马动脉炎病毒GL蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA的初步建立

在分析马动脉炎病毒GL蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆GL蛋白一段抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因插入pET-32a的BamHⅠ和XhoⅠ之间构建了GL蛋白主要抗原域原核表达载体pET-GL1。将pET-GL1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了EAV GL蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His.Bind亲和层析柱纯化重组EAV-GL1蛋白,以纯化的重组GL1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为9.65μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用iGL1-ELISA对马血清样品进行检测,结果表明iGL1-ELISA与病毒中和试验的符合率达到94.1%,与国外同类试剂盒的符合率达到95.6%。

鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。

人巨细胞病毒AD169株UL115基因编码gL蛋白序列分析及B细胞表位预测

目的:分析人巨细胞病毒(HCMV)AD169株UL115基因序列,预测UL115基因编码的gL蛋白B细胞优势表位。方法:基于UL115基因编码的gL蛋白的氨基酸序列,结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVgL蛋白的B细胞表位进行预测,参照已建立的预测方法综合评价B细胞优势表位。结果:①UL115核酸变异集中在序列的N端,大部分是同义突变,氨基酸序列高度保守;②HC-MVgL蛋白B细胞表位可能位于编码蛋白N段197～205、253～261位。结论:多参数预测gL蛋白的B细胞优势表位,为进一步研究蛋白特征、制备单克隆抗体及表位疫苗提供依据。

基于gL蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhintracheitis,IBR)的血清学诊断方法,本试验对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhintracheitis virus,IBRV)gL蛋白进行原核表达和纯化,作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果显示,iELISA方法的最优反应条件:抗原包被质量浓度为0.773 mg/L,4℃过夜;3%BSA、37℃封闭1 h;血清1∶20稀释,室温孵育30 min;二抗稀释度为1∶5000,37℃孵育30 min;底物反应条件为37℃5 min。特异性试验结果显示,该方法仅与IBR阳性血清反应呈阳性,而与牛口蹄疫(FMD)、牛病毒性腹泻(BVD)、布鲁菌病的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,阳性血清1∶640稀释时检测结果仍呈阳性,表明该方法敏感性较高。重复性试验结果显示,批内变异系数为1.9%~7.7%,批间变异系数为2.6%~4.6%。对171份牛血清进行IBRV抗体检测,本试验建立的iELISA方法检出阳性样品67份,阳性率为39%;商品化试剂盒检出阳性样品60份,阳性率为35%,二者的阴性符合率为89.6%,阳性符合率为93.6%。本试验建立的iELISA方法可用于IBR的临床检测,为IBR的检疫防控提供技术支持。

SH3GL2在无病灶性难治性癫癎患者脑组织中的表达

目的:分析无病灶性难治性癫患者脑组织中SH3GL2 mRNA与蛋白的表达水平,探讨可能的发病机制。方法:运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测10例无病灶性难治性癫患者及10例对照组脑组织SH3GL2 mRNA及蛋白的表达。结果:RT-PCR检测显示,无病灶性难治性癫患者脑组织SH3GL2 mRNA表达的相对水平为(102.23±54.68),对照组为(44.59±17.12),两者差异有显著统计学意义(P<0.01);Westernblot分析表明,无病灶性难治性癫患者脑组织的SH3GL2蛋白表达相对水平(229.54±89.82)高于对照组(143.88±59.69),两者差异也有显著统计学意义(P<0.05)。结论:SH3GL2 mRNA与蛋白表达水平在无病灶性难治性癫患者脑组织中明显增强,提示表达于中枢神经系统的SH3GL2可能在人类难治性癫的发病机制中起了一定作用。