产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL 7 ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达 ,将GL 7 ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列 ,并将其连接到质粒pET 2 8a ,通过筛选得到了表达GL 7 ACA酰化酶的重组菌BL2 1 (DE3) /pET ACY。分别考察了诱导温度、菌浓 (OD60 0 )、诱导剂IPTG的用量等因素对重组菌表达GL 7 ACA酰化酶的影响。在优化条件下 ,GL 7 ACA酰化酶酶活可达 2 66U/L。GL 7 ACA酰化酶经一步DEAE Sepharose纯化即可达到 80 %的纯度 ,酶活收率为 5 0 %。

国产固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-ACA的工艺优化

通过对国产固定化GL-7-ACA酰化酶和游离酶的表观米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定.结果表明:固定化GL-7-ACA酰化酶的Km和Vm值分别为8.69 mm o l.L-1和76μm o l.g-1m i-n 1,均较游离酶高;在对酶促反应的关键参数底物质量浓度、转化温度、转化pH进行优化后,用固定化GL-7-ACA酰化酶在底物GL-7-ACA质量浓度30 g.L-1、转化温度25℃、转化pH 8.0的条件下转化GL-7-ACA制备7-ACA可连续操作150批以上,转化率和收率均达95%以上.

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp .130的戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL 7 ACA酰化酶进行了同源性比较 ,结果显示该酶与来源于假单孢菌GK16和C42 7的酰化酶的序列有较高同源性 ,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N 末端差别较大 ,但是 β 亚基的N

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。

产GL-7-ACA酰化酶重组菌的构建及高表达研究

戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶是7-氨基头孢烷酸(7-ACA)两步酶法生产中的关键酶。成功构建组成型表达的产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌JM105/pMKC-ACY,并对其高表达条件进行了研究,得到了组成简单、廉价的国产培养基配方及操作简便、易于实现工业化的发酵工艺。在优化条件下,上罐补料高密度发酵的酶活高达6668.9U/L,是优化前的12.4倍,产率最高可达275.5U/(L.h),达到了工业生产的要求。

GL-7-ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHI酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps.130染色体DNA片段构建重组质粒,并用^(32)P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经^(125)I一标记的抗体/抗原放射免疫反应、GL-7-ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR7 DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6.8kb,质粒pMR 6则带有5.7kb的外源片段。实验还比较了重级质粒pMR5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL-7-ACA酰化酶的表达水平。

GL-7-ACA酰化酶发酵培养基的均匀优化设计

采用国产原料,应用均匀设计优选试验方法,对GL-7-ACA酰化酶生产用的发酵培养基配方进行了优化,取得了良好的效果,最终摇瓶效价达3919.03 U/L。

芽孢杆菌产生的胞外GL-7-ACA酰化酶

半合成头孢菌素因其低毒与广谱抗菌活性,临床应用日益增多.生产这些头孢菌素的关键中间体7—氨基头孢烷酸(7-ACA)由头孢菌素C(CPC)经化学裂解制得.由于化学转化需使用有毒化合物,具危险性,故现已逐渐被酶解法取代.在工业生产上,优先选用的是两步酶解工艺(图1).

GL-7-ACA酰化酶研究进展

对两步酶法生产7-氨基头孢烷酸所必需的GL-7-ACA酰化酶的研究进展进行了综述,并比较了现阶段GL-7-ACA酰化酶的重组表达水平,在此基础上对两步酶法的发展方向进行了分析。

带His标签的GL-7-ACA酰化酶一步纯化及固定化

GL-7-ACA酰化酶（GLA）能将GL-7-ACA转化为7-ACA，后者是半合成头孢菌素类抗生素的起始材料。本研究构建了四种带his标签的GLA，它们之间的N-端氨基酸序列不同。其中重组菌株BL21（DE3）／pET28GA01的GLA活性最大，在19h后达到3800u／L。将GLA分别固定化于TALON亲和载体、EPI—IDA—Co^2＋琼脂糖凝胶和FP—IDA-Ni^2＋树脂后，采用一步纯化和固定化方法进行活性测定，

金属螯合载体一步纯化与固定化GL-7ACA酰化酶

采用金属鳌合亲和层析技术,以EIP-ARG-IDA-Co^2＋为载体,从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7ACA酰化酶.在此基础上进行了固定化方面的研究,其固定化最适条件是150-200U/g给酶量与载体比,固定化时间16 h,固定化介质pH=7.0.固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0.同时还考察了固定化酶的热稳定性、重复利用性及载体的重复使用等特性.

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(E.coliBL21(DE3)pYW-GA)发酵工艺的优化

探索了组成型重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达GL-7ACA酰化酶(EC.3.1.5.11)的发酵工艺.在摇瓶培养获得GL-7ACA酰化酶工程菌的最佳发酵条件的基础上,用5L自控发酵罐进行分批补料培养,为减少细菌代谢过程中有害的物质(主要是乙酸)的产生及酶的高效表达,发酵过程中采用不同的流加方式进行补料,同时对转速和溶氧等进行控制.考察了恒速流加、pH反馈流加和指数流加几种补料模式,比较得出菌浓最高的是pH8.0反馈流加这一模式,OD600可达35,而酶活最高的模式是pH7.0反馈流加,最高酶活可达3 463.8 U/L.大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达GL-7ACA酰化酶的发酵工艺的建立为工业化生产GL-7ACA酰化酶和头孢类抗生素提供了基础.

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶 (3 1 5 11)可有效催化GL 7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成 7 氨基头孢烷酸 (7 ACA)而成为两步酶法生产 7 ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL 7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR2 0 4 pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7 5～ 8 5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4 0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过 5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率 ,即比酶活看 。

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7ACA)酰化酶能够催化GL 7ACA分解生成 7 ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL 7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL 7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β 半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。

酶法生产7-氨基头孢烷酸的研究进展

氨基头孢烷酸 (7 ACA)是生产头孢菌素的重要原料 ,目前都由头孢菌素C通过化学法或生物酶法生产。综述了利用酶法生产 7 ACA的研究进展 ,其中涉及催化过程所用两种酶 (D 氨基酸氧化酶和GL 7 ACA酰化酶 )的酶学特性、表达、纯化。

酶法转化头孢菌素C成为7-氨基头孢烷酸的研究进展

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产头孢菌素的重要原料,目前大多由头孢菌素C通过化学法或酶法转化而来。本文综述了两步酶法生产7-ACA的研究进展,并详细阐述了催化过程用到的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶的酶学特性、表达、纯化及固定化。

酶法转化头孢菌素C成为7-氨基头孢烷酸的研究

7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是生产头孢菌素的重要原料，目前大多由头孢菌素C通过化学法或酶法转化而来。本文综述了两步酶法生产7-ACA的研究进展，并详细阐述了催化过程用到的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶的酶学特性、表达、纯化及固定化。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。