产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL 7 ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达 ,将GL 7 ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列 ,并将其连接到质粒pET 2 8a ,通过筛选得到了表达GL 7 ACA酰化酶的重组菌BL2 1 (DE3) /pET ACY。分别考察了诱导温度、菌浓 (OD60 0 )、诱导剂IPTG的用量等因素对重组菌表达GL 7 ACA酰化酶的影响。在优化条件下 ,GL 7 ACA酰化酶酶活可达 2 66U/L。GL 7 ACA酰化酶经一步DEAE Sepharose纯化即可达到 80 %的纯度 ,酶活收率为 5 0 %。

金属螯合载体一步纯化与固定化GL-7ACA酰化酶

采用金属鳌合亲和层析技术,以EIP-ARG-IDA-Co^2＋为载体,从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7ACA酰化酶.在此基础上进行了固定化方面的研究,其固定化最适条件是150-200U/g给酶量与载体比,固定化时间16 h,固定化介质pH=7.0.固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0.同时还考察了固定化酶的热稳定性、重复利用性及载体的重复使用等特性.

GL-7-ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHI酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps.130染色体DNA片段构建重组质粒,并用^(32)P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经^(125)I一标记的抗体/抗原放射免疫反应、GL-7-ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR7 DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6.8kb,质粒pMR 6则带有5.7kb的外源片段。实验还比较了重级质粒pMR5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL-7-ACA酰化酶的表达水平。

GL-7-ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp.130)染色体上克隆得到的6.8kb的GL-7-ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、Hind Ⅱ、Cla Ⅰ切点,分别具有一个Hpa Ⅰ、两个Xho Ⅰ、三个BamH Ⅰ以及四个Pst Ⅰ切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL-7-ACA酰化酶基因已被定位在3.0kb的B_2-B_3-Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYC184、pDR540、pUC10等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMR10和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMR10的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMR11),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。

GL-7-ACA酰化酶的固定化工艺条件优化

采用单因素和Box-Behnken实验对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的工艺条件进行优化。首先通过单因素设计研究载体用量、缓冲液pH值、时间、温度四个因素对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶活力的影响,在此基础上,利用响应面试验设计对LX-1000EP树脂固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的条件进行优化。载体用量、缓冲液pH值、时间、温度对固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶都有影响,固定化最佳工艺条件为:载体用量3.3 g、pH值7.9、时间40 h、温度25℃,在此条件下固定化酶活力达到(69.5±0.8)U/g,酶活回收率达到42.41%。将响应面法应用于固定化戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶条件的优化是可行的。

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp .130的戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL 7 ACA酰化酶进行了同源性比较 ,结果显示该酶与来源于假单孢菌GK16和C42 7的酰化酶的序列有较高同源性 ,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N 末端差别较大 ,但是 β 亚基的N

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(E.coliBL21(DE3)pYW-GA)发酵工艺的优化

探索了组成型重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达GL-7ACA酰化酶(EC.3.1.5.11)的发酵工艺.在摇瓶培养获得GL-7ACA酰化酶工程菌的最佳发酵条件的基础上,用5L自控发酵罐进行分批补料培养,为减少细菌代谢过程中有害的物质(主要是乙酸)的产生及酶的高效表达,发酵过程中采用不同的流加方式进行补料,同时对转速和溶氧等进行控制.考察了恒速流加、pH反馈流加和指数流加几种补料模式,比较得出菌浓最高的是pH8.0反馈流加这一模式,OD600可达35,而酶活最高的模式是pH7.0反馈流加,最高酶活可达3 463.8 U/L.大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pYW-GA高效表达GL-7ACA酰化酶的发酵工艺的建立为工业化生产GL-7ACA酰化酶和头孢类抗生素提供了基础.

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶 (3 1 5 11)可有效催化GL 7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成 7 氨基头孢烷酸 (7 ACA)而成为两步酶法生产 7 ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL 7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR2 0 4 pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7 5～ 8 5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4 0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过 5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率 ,即比酶活看 。

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7ACA)酰化酶能够催化GL 7ACA分解生成 7 ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL 7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL 7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β 半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。

GL-7ACA酰化酶的提取

假单孢菌79u-18菌株产生GL-7ACA的同时产生β-内酰胺酶。我们找到了一种简单有效的方法使β-内酰胺酶失活而不影响GL-7ACA酶活力。用冻融 -溶媒法提胞内酶GL-7ACA。酶回收率达60％以上,可用于工业化生产。

高产GL-7ACA酰化酶菌株的获得及其培养条件的研究

从假单胞菌的野生菌株SP-821出发,经化学、物理诱变,获得GL-7ACA酰化酶高产菌株79u-18,酶活性高达700u/L。在菌株选育过程中一个突破性进展是分离获得构成型GL-7ACA酰化酶产生菌株,即该菌在培养中不需加入戊二酸作诱导剂。本文介绍上述菌株的获得及培养条件的研究。

GL-7-ACA酰化酶发酵培养基的均匀优化设计

采用国产原料,应用均匀设计优选试验方法,对GL-7-ACA酰化酶生产用的发酵培养基配方进行了优化,取得了良好的效果,最终摇瓶效价达3919.03 U/L。

酶法生产7-氨基头孢烷酸的研究进展

氨基头孢烷酸 (7 ACA)是生产头孢菌素的重要原料 ,目前都由头孢菌素C通过化学法或生物酶法生产。综述了利用酶法生产 7 ACA的研究进展 ,其中涉及催化过程所用两种酶 (D 氨基酸氧化酶和GL 7 ACA酰化酶 )的酶学特性、表达、纯化。

一步酶法生产7-氨基头孢烷酸的研究进展

7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,一般由头孢菌素C通过化学法或生物酶法裂解脱去侧链分子制备得到。综述了头孢菌素C酰化酶的来源、特性及其基因的克隆和改造,表达与纯化,固定化及其催化工艺的研究,并展望了一步酶法生产7-氨基头孢烷酸的应用前景。

用固定化大肠埃希氏菌基因工程菌株转化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸为7-氨基头孢烷酸的研究

用乙酸纤维将ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶基因工程菌大肠埃希氏菌Ａ５６／ｐＭＲＣＵ－３３４菌株固定化，酶反应的最适温度为５０℃，最适ｐＨ为８．０，与游离细胞一致；固定化细胞对温度和ｐＨ的稳定性比游离细胞提高。用薄板层析分析固定化细胞裂解ＧＬ－７－ＡＣＡ反应液中产物７－ＡＣＡ的含量以及ＧＬ－７－ＡＣＡ的残存量，在ｐＨ８．０．３７℃时ＧＬ－７－ＡＣＡ的转化率达９０％，产生７－ＡＣＡ的能力为１２．３４ｍｇ／（ｇ固定化细胞·ｈ）。使用２０批之后，ＧＬ－７－ＡＣＡ的转化率仍达６６％。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

游离细胞催化与膜分离耦合制备7-氨基头孢烷酸的工艺研究

利用产D-氨基酸氧化酶(DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GLA)的高酶活重组大肠杆菌,对双酶催化制备7-ACA的工艺进行了研究。提出了一条游离细胞反应与膜分离耦合的7-ACA生产新工艺:用游离细胞进行催化,用超滤膜进行细胞和产物的分离。结果发现用中空纤维超滤膜可以将反应体系中的细胞和催化产物分离,分离得到的细胞可重复使用;分离得到的反应液经一步结晶,7-ACA纯度为93.1%,结晶收率为51%。

酶法转化头孢菌素C成为7-氨基头孢烷酸的研究进展

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产头孢菌素的重要原料,目前大多由头孢菌素C通过化学法或酶法转化而来。本文综述了两步酶法生产7-ACA的研究进展,并详细阐述了催化过程用到的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶的酶学特性、表达、纯化及固定化。

酶法转化头孢菌素C成为7-氨基头孢烷酸的研究

7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是生产头孢菌素的重要原料，目前大多由头孢菌素C通过化学法或酶法转化而来。本文综述了两步酶法生产7-ACA的研究进展，并详细阐述了催化过程用到的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶的酶学特性、表达、纯化及固定化。