锌指蛋白146下调对荧光素酶标记的胶质瘤细胞GL261-luc活性的影响

目的观察DNA损伤修复蛋白——锌指蛋白146(RNF146)下调对荧光素酶稳转胶质瘤细胞株GL261-luc活性的影响。方法通过干涉慢病毒感染的方法,下调荧光素酶稳转胶质瘤细胞株GL261-luc中RNF146的表达,经实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测GL261-luc细胞中RNF146的敲减效率。Western blot检测RNF146下调后GL261-luc细胞中荧光素酶蛋白的表达水平。比较第1代、第15代和第30代GL261-luc细胞中荧光素酶活性。结果RNF146干涉慢病毒感染能够下调GL261-luc细胞中RNF146基因表达约为85.7%(P<0.01);Western blot检测结果也显示GL261-luc细胞RNF146的蛋白表达下调超过85.0%(P<0.001)。RNF146下调不影响荧光素酶基因的表达、酶的活性和酶的稳定性(P均>0.05)。结论用慢病毒感染下调GL261-luc细胞RNF146表达,不影响荧光素酶的表达、活性及稳定性,能够用于后续小动物体内成瘤后的活体成像研究。

杨梅黄酮对小鼠脑胶质瘤GL261细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察杨梅黄酮对小鼠脑胶质瘤GL261细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,为杨梅黄酮应用于胶质瘤的治疗提供理论依据。方法:体外培养小鼠脑胶质瘤GL261细胞,实验分为对照组和不同浓度杨梅黄酮组,应用CCK-8法检测细胞的存活率,流式细胞术检测各组GL261细胞的细胞周期,Hoechst 33342染色及流式细胞术检测各组GL261细胞的细胞凋亡情况,应用Transwell小室检测各组GL261细胞迁移数目和进入小室下部的细胞数量,应用RT-PCR法检测杨梅黄酮处理前后GL261细胞中基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA的表达水平。结果:CCK8法检测,与对照组比较,20μmol·L^(-1)杨梅黄酮组细胞存活率明显下降(P<0.01)。细胞周期检测,与对照组比较,40μmol·L^(-1)杨梅黄酮处理组GL261细胞G1期比例升高(P<0.05),S期比例降低(P<0.05)。Hoechst 33342染色,杨梅黄酮组GL261细胞出现凋亡小体。流式细胞术AnnexinⅤ/PI荧光双染检测,与对照组比较,杨梅黄酮组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均增加(P<0.05)。Transwell小室迁移和侵袭实验,与对照组比较,5、10和20μmol·L^(-1)杨梅黄酮组发生迁移的细胞数目明显减少(P<0.05)。Transwell小室检测,与对照组比较,杨梅黄酮组进入下室的细胞数目明显减少(P<0.05),且随着杨梅黄酮浓度的增加,穿过Matrigel的细胞数目逐渐减少。与对照组比较,5和10μmol·L^(-1)杨梅黄酮组GL261细胞中MMP-2和MMP-9mRNA表达水平均降低(P<0.05)。结论:杨梅黄酮可抑制胶质瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,并抑制其迁移及侵袭。

羧胺三唑乳清酸盐抑制小鼠胶质瘤细胞系GL261增殖及线粒体能量代谢

目的研究羧胺三唑乳清酸盐(CTO)对小鼠胶质瘤细胞系GL261增殖和凋亡的影响。方法体外培养小鼠胶质瘤细胞系GL261,实验分为对照组和不同浓度CTO组,采用活细胞计数检测细胞增殖;采用碘化丙啶(PI)染色及流式细胞测量术检测各组GL261的细胞周期;采用annexinⅤ/PI双染色及流式细胞测量术检测各组GL261的细胞凋亡,并计算凋亡率;采用DCFH-DA染色及流式细胞测量术检测各组GL261细胞内活性氧(ROS)的含量;通过Seahorse生物能量仪检测各组GL261细胞的耗氧速率(OCR);采用三磷酸腺苷(ATP)生物发光法检测各组GL261细胞内ATP的含量。结果与对照组相比,CTO处理组中GL261活细胞数目明显较少,药物作用呈时间-剂量依赖性,20μmol/L CTO组GL261细胞S期比例明显升高(P<0.05);与对照组相比,CTO处理组中GL261细胞发生凋亡,药物作用呈时间-剂量依赖性,20μmol/L CTO组GL261细胞内的ROS含量也明显升高(P<0.01);与对照组相比,CTO处理组中GL261细胞内的OCR和ATP含量都明显降低(P<0.01)。结论CTO可以抑制小鼠胶质瘤细胞系GL261增殖,通过增加ROS的生成促进其凋亡;CTO能够损伤GL261细胞的线粒体呼吸,抑制线粒体中ATP的产生,达到抑制胶质瘤细胞生长的作用。

miR-106a-5p靶向STAT3抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭的机制

目的探究miR-106a-5p靶向信号转导和转录激活因子3(STAT3)调控胶质瘤细胞增殖和侵袭的机制。方法选取2017年1月至2020年12月接受再次手术治疗的脑复发胶质瘤患者肿瘤组织15例及癌旁脑组织(距瘤缘>1.5 cm)5例,体外培养正常小鼠神经元细胞和胶质瘤细胞株GL261,qPCR检测miR-106a-5p水平。将构建的miRNA-NC mimics、miR-106a-5p mimics、miR-106a 5p inhibitor质粒转染GL261作为实验组,正常GL261作为Control组,qPCR检测各组细胞miR-106a-5p、STAT3表达。应用Targetsan预测和双荧光素酶基因报告验证miR-106a-5p与STAT3的靶向关系;CCK-8,Transwell检测各组细胞增殖和侵袭;蛋白质印迹测定凋亡相关蛋白BAX、cl-caspase-3和抑癌基因p21水平。结果miR-106a-5p在人复发胶质瘤组织和GL261中表达显著低于癌旁组织和正常小鼠神经细胞(P<0.05),相比Control组,miR-106a-5p mimics组GL261中miR-106a-5p水平显著升高、STAT3表达显著下降(P<0.01)。miR-106a-5p inhibitor组结果相反(P<0.05)。Targetsan预测和双荧光素酶基因报告证实了STAT3是miR-106a-5p的靶基因。此外,miR-106a-5p mimics组中STAT3表达显著下调,GL261增殖和侵袭明显减少(P<0.05),BAX、cl-caspase-3、p21的表达均显著上升(P<0.05);miR-106a-5p inhibitor组相反(P<0.05)。结论miR-106a-5p低表达于人复发胶质瘤组织和GL261中,通过负调控STAT3表达调节胶质瘤细胞的增殖和侵袭,为研究胶质瘤的复发提供一种新的靶点。

HIF-1α慢病毒干扰载体构建及GL261小鼠胶质瘤稳定沉默细胞系的建立

目的研究短发夹状RNA(shRNA)干扰慢病毒表达载体对小鼠胶质瘤GL261细胞系中乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的沉默效应。方法构建针对小鼠胶质瘤GL261细胞HIF-1αmRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,筛选出HIF-1α基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pLenti6.3-shR-NA3慢病毒载体感染靶细胞GL261,获得稳定沉默HIF-1α细胞株,利用实时定量PCR和Western blot方法检测稳定细胞株HIF-1α的沉默效应。结果成功构建了具有HIF-1α沉默效应的慢病毒干扰载体,通过倍比稀释测定干涉病毒滴度为1.15×108TU/mL。实时定量PCR和Western blot实验均证实慢病毒转染后,GL261细胞株中HIF-1α表达水平明显降低。结论针对HIF-1α基因不同位点的不同shRNA具有干扰效率的差异。特异性的shRNA可稳定地介导HIF-1α基因沉默。

激活Sting信号通路对GL261小鼠肿瘤模型远隔免疫效应影响

目的放疗过程中受照射病灶以外其他部位病灶消退的现象称为远隔效应,远隔效应的机制主要与免疫相关,干扰素刺激因子(stimulator of interferon genes,Sting)信号通路的激活在放疗引起免疫效应机制中起着非常重要的作用。但Sting信号通路的激活对诱发远隔效应的作用尚不明确。本研究探讨不同照射剂量对GL261小鼠胶质瘤模型Sting信号通路的激活,以及激活的Sting信号通路对原发及远隔部位肿瘤微环境中抗肿瘤免疫效应的影响。方法细胞实验:予GL261细胞系0、8和20Gy X射线照射后培养24h收集细胞,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)检测免疫相关因子Sting和干扰素b(interferon-b,IFNb)的表达水平;蛋白质印迹法检测GL261细胞系Sting蛋白的表达变化。体内实验:构建小鼠两侧背部肿瘤模型,令各组别小鼠的一侧肿瘤达150mm^3,分别接受0、8和20Gy的X射线照射,照射后第5日处死小鼠并取肿瘤组织。蛋白质印迹法检测接受照射的原位肿瘤及远隔肿瘤组织内Sting蛋白表达水平,并利用ELISA试剂盒检测原位及远隔肿瘤组织中IFNb蛋白表达水平,最后通过流式细胞术检测原位及远隔肿瘤组织微环境内树突状细胞(dendritic cells,DC)及效应T(CD8a+T)细胞浸润情况。结果在体外细胞水平研究中,RT-PCR检测发现,8和20Gy照射后细胞内Sting表达较0Gy组呈增加趋势,P>0.05;8和20Gy照射后IFNb表达量分别为4.01±0.16、4.19±0.44,较对照组增加,F=39.751,P<0.001。蛋白质印迹结果提示,8、20Gy照射后细胞内Sting蛋白表达量分别为1.53±0.12、2.31±0.03,均较对照组增加,F=74.835,P<0.001。在体内小鼠动物模型研究中,蛋白质印迹检测发现,8Gy照射组原位组织(1.99±0.11)及远隔组织(1.36±0.05)中Sting蛋白表达量均较对照组增加,P值分别为<0.001和0.002;20Gy照射组原位(0.347±0.006)及远隔组织(0.177±0.008)Sting蛋白表达较对照组减少,均P<0.001。进一步使用ELISA试剂盒检测发现,仅8Gy照射组小鼠原位肿瘤组织中IFNb蛋白表达〔(111.74±13.96)pg/mL〕较对照组〔(68.84±2.40)pg/mL〕增高,F=4.345,P<0.05。流式细胞术检测发现,8Gy照射组小鼠原位肿瘤组织中DC〔(3.48±0.43)%〕及CD8a+T〔(5.28±0.77)%〕细胞浸润量均较对照组增加,F=6.793,P<0.05;而20Gy照射组原位肿瘤组织中DC及CD8a+T细胞浸润较对照组差异无统计学意义,P>0.05。结论 8Gy X射线照射能激活GL261小鼠模型中的Sting信号通路,促进免疫相关因子的表达,最终通过引起原位及远隔部位肿瘤组织中DC、CD8a+T细胞浸润增加达到增强其抗肿瘤免疫的作用。