高通量GLGI鉴定及分析白念珠菌LongSAGE标签

目的鉴定并初步分析白念珠菌长片段基因表达序列分析(LongSAGE)标签。方法建立了一种高通量鉴定LongSAGE标签的技术,应用该技术可批量扩增白念珠菌LongSAGE标签,使其由17bp扩增至相应的3'cDNA末端,扩增产物TA克隆后进行测序及序列分析(GLGI)。结果30条多重匹配标签中28条得到稳定有效的扩增,40个无匹配标签中30条得到有效扩增,其中21条证实为新表达序列标签(EST),可能代表新的基因,9条和已知基因有一定同源性,可能是已知基因或其同一家族基因。结论应用高通量GLGI技术成功鉴定了白念珠菌LongSAGE标签,为进一步研究白念珠菌菌相转换机制奠定了基础。

GLGI技术鉴定奶山羊乳腺中的κ-酪蛋白基因

采用GLGI技术扩增本实验室构建的Long-SAGE标签库中的κ-酪蛋白基因。使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通过RT-PCR把奶山羊乳腺组织中的mRNA逆转录成cDNA,分别用3’RACE和5’RACE扩增κ-酪蛋白基因的3’端和5’端。扩增产物经TA克隆后转化大肠杆菌,随机挑取阳性克隆后进行测序分析。通过序列比对、拼接,获得全长的κ-酪蛋白基因。应用GLGI技术成功获得了完整的奶山羊乳腺CSN3序列,为CSN3结构分析和功能研究奠定了重要基础。

GLGI技术初步验证系统性红斑狼疮患者CD4^+、CD8^+T细胞基因表达谱

目的研究GLGI技术鉴定系统性红斑狼疮患者LongSAGE标签的方法。方法运用GLGI技术,将包括17 bp的SAGE标签及单一碱基和oligo(dT)锚定引物进行PCR扩增,得到表达基因的3′端序列,并确认表达基因。结果单一匹配标签12个有9个获得有效扩增,包括原来的17 bp的SAGE标签序列,其长片段测序后有＞85%的碱基与已知基因相符合,表明为该已知基因。20个无匹配标签中未发现有新的基因。结论GLGI技术能够有效识别基因,LongSAGE-GLGI技术是鉴定SAGE大规模标签库较好的方法。

家蚕LongSAGE文库鉴定及延长标签的改进GLGI方法

结合标签的基因序列延伸(GLGI)是随着基因表达序列标签(SAGE)应运而生的一种鉴定新标签的技术。为了克服该技术操作繁琐、成本高的弊端,根据已经构建的家蚕限性茧色品种的2个LongSAGE文库,选择30个差异表达的标签(tag)进行GLGI延伸。尝试了几个简化,(1)用totalRNA代替mRNA进行dsDNA的合成;(2)调整磁珠吸附DNA的顺序;(3)在PCR反应中用普通的DNA聚合酶代替高保真酶(Pfu)。结果显示,30个标签有27个获得有效扩增,扩增序列真实包括了SAGE标签的17bp序列,3个标签的结果符合NCBI的家蚕数据库已有注释,13个未注释标签经过延长后得到了注释,11个标签序列为待确定的新基因序列。这种简化能够作为家蚕SAGE文库其他tag和新基因研究的有效简化操作体系。与传统的方法相比,可减少成本30%以上,缩短操作时间20%。

利用SAGE标签产生长片段cDNA应用于白念珠菌基因识别

目的鉴定本实验室建立的白念珠菌LongSAGE文库。方法运用利用SAGE标签产生长片段cDNA应用于基因识别(GLGI)技术将白念珠菌的酵母相和菌丝相17bp的LongSAGE标签扩增至相应的3′cDNA端,获得数百个碱基片段,并进行序列分析。结果20个标签中有15个获得稳定有效的扩增,长度在200～1000bp之间,获得的长片段进行序列分析后,有超过95%的碱基与已知基因相同,并且包括原来17bp的SAGE标签,表明获得的序列为此已知基因。结论研究表明,用SAGE标签作为引物,可有效地识别基因。利用SAGEGLGI技术可以用来说明更多的白念珠菌的表达基因序列和其它真核生物的基因组。

奶山羊乳腺组织中基因CCDC85B的克隆

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。从本实验室前期建立的基因文库中挑选出CCDC85B的17 bp标签,采用GLGI和RACE技术进行扩增,获得基因的全长。结果表明,扩增片段长度为1 282 bp序列,其中编码区为606 bp,编码202个氨基酸残基,BLAST比对结果显示,该序列与已知牛、人CCDC85B的同源性分别为100%和83%,证明此基因确为奶山羊乳腺组织中的CCDC85B,为该基因的进一步结构分析和功能研究奠定基础。