利用CRISPR/Cas9技术构建GLRX3基因敲除的HEK293细胞系

为了构建GLRX3(Glutaredoxin 3)敲除的HEK293细胞系,根据该蛋白结构特性设计了靶向于GLRX3基因Exon5的4个sgRNA,并通过T7E1检测确认了所设计sgRNA的有效性。将携带Cas9及靶向hGLRX3-Exon5的sgRNA1的打靶载体转染HEK293,通过药物Puromycin和细胞克隆化筛选出稳定GLRX3基因敲除的HEK293细胞株,并通过测序确定GLRX3两个等位基因均发生移码突变。通过免疫印迹在蛋白表达水平确认了该基因的敲除。利用CRISPR/Cas9技术成功构建了GLRX3敲除的HEK293细胞株,其为探索GLRX3的功能和作用机制提供了有效的细胞模型。

敲除GLRX3基因对鼻咽癌细胞生物学的影响

目的建立稳定敲除GLRX3(glutaredoxin 3)基因的鼻咽癌细胞株,探索GLRX3基因在鼻咽癌细胞中的生物学功能。方法构建人GLRX3基因的shRNA逆转录病毒载体,将其转染入鼻咽癌细胞株HONE1中,筛选、建立稳定敲除GLRX3基因的HONE1细胞株。采用实时荧光定量PCR法验证筛选细胞中GLRX3基因的转录水平,通过克隆形成实验和划痕实验检测敲除GLRX3基因后鼻咽癌细胞克隆形成能力及迁移运动能力,评价敲除GLRX3基因后鼻咽癌细胞生物学行为的改变情况。结果成功构建的4个GLRX3 shRNA-pBINNS2质粒载体均可抑制GLRX3基因的转录表达。敲除GLRX3基因的HONE1细胞的克隆形成能力及迁移运动能力均降低。结论敲除GLRX3基因可抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为,GLRX3可能是鼻咽癌候选的癌基因。

鼻咽癌中GLRX3的表达及其对铁代谢和Wnt/β-catenin信号通路调控机制的研究

目的探究GLRX3在鼻咽癌(NPC)中的表达及其对铁代谢的影响和相关通路的调控。方法利用免疫组化检测鼻咽癌组织与癌旁组织中GLRX3的表达水平;采用RT-PCR检测组织中GLRX3 mRNA的表达水平;将人鼻咽癌上皮细胞HONE1设置为4组,分别为未转染的细胞对照组(Control组),转染对照序列shRNA-NC的细胞阴性对照组(shNC组),转染序列shRNA-GLRX3的细胞组(shGLRX3组),铁离子螯合剂处理细胞组(DFO组);RT-PCR与Western blot检测各组细胞中GLRX3、Ferritin、TFR1、Wnt1、β-catenin的mRNA和蛋白表达水平;采用CCK-8法和Transwell法分别检测上述各组细胞的增殖和侵袭能力。结果与癌旁组织相比,鼻咽癌组织中GLRX3 mRNA的表达显著增加(P<0.05)。与Control组和shNC组相比较,shGLRX3组细胞中GLRX3 mRNA及蛋白的表达水平均显著下调(P<0.05),前两组无明显差异(P>0.05)。同时,shGLRX3组铁代谢相关蛋白Ferritin、TFR1的表达较Control组显著降低(P<0.01);shGLRX3组与DFO组细胞的增殖与侵袭能力较Control组细胞均显著降低(P<0.01),前两组无明显差异(P>0.05)。且shGLRX3组细胞和DFO组细胞中Wnt1、β-catenin的mRNA及蛋白的表达也显著降低(P<0.05)。结论降低鼻咽癌中高表达的GLRX3可能通过下调肿瘤细胞的铁代谢相关蛋白,抑制细胞的增殖与侵袭能力,这可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活相关。

谷氧还蛋白3基因表达对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的观察抑制谷氧还蛋白3（GLRX3）基因表达对肺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。方法Western blot检测人胚肺成纤维细胞MRC5及肺癌A427、A549、PC9、H1299细胞中GLRX3的蛋白表达。采用RNA干扰技术，将合成的GLRX3 siRNA转染A549细胞（实验组），转染阴性siRNA的A549细胞作为阴性组，不经特殊处理的A549细胞为空白组。Western blot检测转染48 h各组细胞中GLRX3、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）、信号转导与转录因子3（STAT3）和p-STAT3的蛋白表达，细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测转染24、48和72 h细胞的增殖情况，流式细胞术检测转染48 h细胞的凋亡情况。结果人胚肺成纤维细胞MRC5及肺癌A427、A549、PC9、H1299细胞中GLRX3的蛋白表达量分别为0.094±0.010、0.282±0.021、0.551±0.045、0.423±0.039和0.454±0.036，肺癌A427、A549、PC9、H1299细胞中GLRX3的蛋白表达量均显著高于MRC5细胞（均P〈0.01）。转染A549细胞24、48和72 h，实验组与空白组吸光度差异均有统计学意义（均P〈0.01）。转染A549细胞48 h，空白组、阴性组和实验组细胞中GLRX3的蛋白表达量分别为0.311±0.029、0.328±0.032和0.103±0.012，实验组显著低于空白组（P〈0.01），阴性组与空白组差异无统计学意义（P〉0.05）；空白组、阴性组和实验组细胞凋亡率分别为（1.65±0.22）%、（1.42±0.26）%和（9.52±0.56）%，实验组细胞凋亡率显著高于空白组（P〈0.01）；实验组cleaved caspase-3的蛋白表达显著高于空白组（P〈0.01），p-STAT3的蛋白表达显著低于空白组（P〈0.01），而STAT3蛋白表达各组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论抑制GLRX3基因表达，可通过上调cleaved caspase-3的表达、下调STAT3信号通路，抑制肺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。