Glt25d1基因通过调节NKT细胞及Treg细胞比例加重Con A诱导的免疫性肝损伤

目的 探讨胶原β(1-O)半乳糖基转移酶[collagen β(1-O) galactosyltransferase 1,COLGALT1/GLT25D1]基因在刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的自身免疫性肝损伤中的作用及可能机制。方法 6~8周雌性野生型(wild type,WT)小鼠和Glt25d1基因敲低杂合子(Glt25d1^(+/-))小鼠分别分为2组(对照组和Con A造模组),每组中WT小鼠和Glt25d1^(+/-)小鼠均各有6只。Con A以10 mg/kg体质量的剂量经内眦静脉丛给药。于造模后12 h处死小鼠。留取血浆,检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)水平,留取肝组织,用于肝组织病理学评估和肝脏GLT25D1蛋白表达量测定。制备肝脏、脾脏及外周血单细胞悬液,运用流式细胞术比较两种小鼠的调节性T(regulatory T,Treg)细胞、自然杀伤T(natural killer T,NKT)细胞比例,并比较NKT细胞表面凋亡相关因子配体(factor related apoptosis ligand,FasL)表达差异。结果 对照组和Con A造模组中Glt25d1^(+/-)小鼠肝组织GLT25D1表达量均显著低于WT小鼠(对照组:0.342±0.168 vs1.144±0.169,t=5.841,P=0.004;Con A造模组:0.264±0.087 vs 0.964±0.058,t=11.640,P=0.0003)。经Con A诱导12 h后,Glt25d1^(+/-)小鼠ALT水平显著高于WT小鼠[(10155.2±4489.5)U/L vs (3078.5±111.0)U/L;t=-3.522,P=0.024]。肝组织HE染色显示Glt25d1^(+/-)小鼠肝板结构损坏更为严重,肝脏坏死区域更加广泛,汇管区炎性细胞浸润更加显著。流式细胞术检测显示,Con A造模组中Glt25d1^(+/-)小鼠脾脏中Treg细胞频数较WT小鼠显著减少[(7.849±1.116)%vs (9.892±1.762)%;t=2.978,P=0.008],肝脏NKT细胞频数[(9.244±6.898)%vs (3.376±4.794)%;t=-2.253,P=0.037]和NKT细胞FasL表达量[(29.62±4.960)%vs (16.43±3.964)%;t=-5.027,P=0.001]显著高于WT小鼠。结论 Glt25d1基因敲低加重Con A诱导的免疫性肝损伤,其机制可能与其降低Treg细胞频数、增加NKT细胞频数及增强NKT细胞功能有关。

GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程相关性分析

目的探讨GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程的相关性。方法通过抗原表位预测软件BepiPred 1.0Server将GLT25D1基因片段分为GLT25D1-1和GLT25D1-2两部分,PCR扩增获得目的片段,构建其原核表达质粒;对制备的多克隆抗体进行效价及特异性分析。通过以GLT25D1为抗原的ELISA双抗体夹心的方法,检测其在HBV感染不同阶段的患者的血清水平。结果成功表达重组蛋白,Western blot鉴定正确;成功制备兔抗人(GLT25D1-1、GLT25D1-2)的多克隆抗体,效价较高,特异性良好。通过ELISA方法检测HBV感染患者血清,慢性乙肝(病理结果不超过S3期)、肝硬化(S3-4期及S4期)以及肝癌患者中GLT25D1的OD值较正常组均有显著性差异(P<0.01)。结论通过血清学检测结果,我们发现GTL25D1存在于HBV感染的肝病的各进程中,进而我们推测血清GLT25D1可能会作为检测肝纤维化进程的一个新的血清学指标。

Glt25d1基因敲低对刀豆蛋白A诱导的自身免疫性肝炎小鼠巨噬细胞和中性粒细胞的影响

目的研究Glt25d1基因在刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导的自身免疫性肝炎中的作用及其对巨噬细胞和中性粒细胞的影响。方法随机抽取6~8周无特定病原体雌性Glt25d1+/-小鼠及与其同窝出生的野生型(wild type,WT)小鼠,体质量(20±2)g,分为WT对照组、Glt25d1+/-对照组、WT造模组和Glt25d1+/-造模组,每组8只。造模组通过内眦静脉注射Con A,剂量为10 mg/kg,对照组给予相同剂量生理盐水注射。造模12 h后处死小鼠。检测小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)水平,观察肝组织病理。采用流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏和肝脏中巨噬细胞和中性粒细胞的比例。采用定量逆转录PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR,qRT-PCR)检测肝脏中单核-巨噬细胞趋化蛋白-1(monocyte/macrophage chemotaxis proteinⅠ,MCP-Ⅰ)、巨噬细胞炎性蛋白1α(macrophage inflammatory proteinⅠα,MIP-Ⅰα)、巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatoryproteinⅡ,MIP-Ⅱ)及淋巴细胞抗原6G(lymphocyteantigen6complexlocusG,Ly6G)等mRNA的相对表达量。结果 WT对照组和Glt25d1+/-对照组小鼠ALT [(52.00±18.19)U/L vs (45.00±6.85)U/L]和AST [(168.17±21.33)U/L vs(276.17±83.37)U/L]水平差异无统计学意义(t值分别为0.360、1.255,P值分别为0.7263、0.2589)。Con A造模12 h后,WT造模组小鼠ALT和AST水平分别为(3089.67±663.92)U/L、(3099.50±519.15)U/L,Glt25d1+/-造模组小鼠ALT和AST水平分别(11565.17±1381.38)U/L、(10875.17±1558.68)U/L,均显著高于未造模组(P均<0.05),Glt25d1+/-造模组小鼠ALT和AST水平均显著高于WT造模组(t值分别为5.530、4.733,P值分别为0.0003、0.0032)。肝组织HE染色示:WT对照组和Glt25d1+/-对照组小鼠肝组织未见明显损伤,Con A诱导12 h后,与WT Con A造模组小鼠相比,Glt25d1+/-造模组小鼠肝脏坏死面积更广、汇管区炎性细胞浸润更显著。Glt25d1+/-对照组小鼠脾脏中巨噬细胞比例显著高于WT对照组[(5.04±0.32)%vs(3.48±0.31)%],差异有统计学意义(t=2.954,P=0.0131),外周血[(0.26±0.09)%vs(0.63±0.16)%]和肝脏[(1.58±0.11)%vs(2.83±0.43)%]中差异无统计学意义(t值分别为1.456、1.626,P值分别为0.1733、0.1351)。Con A诱导12h后,与WT造模组相比,Glt25d1+/-造模组小鼠外周血中巨噬细胞比例显著降低[(0.12±0.21)%vs (0.43±0.10)%,t=2.955,P=0.0144],肝脏中巨噬细胞比例显著升高[(8.34±0.30)%vs (1.03±0.53)%,t=6.992,P=0.0002],脾脏中巨噬细胞比例无显著差异[(3.98±0.39)%vs (3.82±0.21)%,t=0.372,P=0.7173]。与WT对照组小鼠相比,Glt25d1+/-对照组小鼠脾脏中中性粒细胞比例显著升高[(5.20±0.76)%vs (2.46±0.35)%,t=3.836,P=0.0028],外周血[(0.67±0.26)%vs (1.96±0.77)%]和肝脏[(3.68±1.33)%vs (3.76±1.12)%]中中性粒细胞比例无显著差异(t值分别为1.078、0.039,P值分别为0.3040、0.9698)。Con A诱导12 h后,与WT造模组小鼠相比,Glt25d1+/-造模组小鼠外周血中性粒细胞比例显著降低[(1.37±0.22)%vs (14.40±2.72)%,t=4.782,P=0.0088],肝脏中巨噬细胞比例显著升高[(8.08±1.93)%vs (1.64±0.71)%,t=3.788,P=0.0043],脾脏中差异无统计学意义[(5.81±0.84)%vs (5.96±0.42)%,t=0.176,P=0.8621]。WT对照组小鼠MCP-Ⅰ、MIP-Ⅰα、MIP-Ⅱ及Ly6G mRNA相对表达量分别为0.66±0.31、1.08±0.23、1.04±0.17、1.05±0.19,Glt25d1+/-对照组小鼠上述指标分别为0.60±0.13、1.56±0.11、0.77±0.07、0.92±0.16,差异均无统计学意义(P均> 0.05)。WT造模组小鼠MCP-Ⅰ、MIP-Ⅰα、MIP-Ⅱ及Ly6G mRNA相对表达量分别为1.29±0.41、1.11±0.18、1.16±0.19、0.90±0.20,Glt25d1+/-造模组小鼠上述指标分别为2.51±0.26、4.72±0.45、2.62±0.36、2.36±0.59,Glt25d1+/-造模组均显著高于WT造模组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 Glt25d1基因敲低可加重小鼠Con A诱导的自身免疫性肝炎,降低外周血巨噬细胞和中性粒细胞比例,升高肝脏中巨噬细胞和中性粒细胞比例,并诱导肝脏细胞因子如MCP-Ⅰ、MIP-Ⅰα、MIP-Ⅱ及Ly6G转录水平升高。

胶原糖基化Glcα1和2Galβ1修饰基因(GLT25D1)敲低小鼠模型的制备与基因型鉴定

目的建立介导胶原糖基化Glcα1、2Galβ1修饰基因(GLT25D1)敲低小鼠模型,为研究其在肝脏疾病中的作用奠定基础。方法基于Cre-loxp重组酶系统,采用胚胎干细胞线性打靶技术,获得同源重组的干细胞,繁殖嵌合体,获得杂合子GLT25D1^(+/-)小鼠。随后将GLT25D1^(+/-)小鼠自交。通过PCR凝胶电泳技术对子代小鼠的基因型进行鉴定。采用Western blot技术检测GLT25D1在WT型小鼠(wild type,WT)和杂合子GLT25D1^(+/-)小鼠各组织的表达。比较WT和GLT25D1^(+/-)小鼠的生育情况、子代小鼠基因型比例及出生20天的体重差异。结果 GLT25D1^(+/-)小鼠配笼繁殖的264只子代小鼠中,杂合子GLT25D1^(+/-)小鼠152只,WT小鼠112只,无GLT25D1-/-小鼠。GLT25D1^(+/-)小鼠数量和WT小鼠数量的比值低于孟德尔遗传定律的2∶1(χ~2=9.818,P=0.002)。Western blot示GLT25D1蛋白在WT小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等重要组织中均有表达,其中在肝、脾和肺中高表达,肾和淋巴结中度表达,心和脑弱表达,GLT25D1^(+/-)小鼠各组织表达水平均低于WT型小鼠。WT和GLT25D1^(+/-)小鼠在外观和行为上无显著差异,GLT25D1^(+/-)小鼠出生后20天体重显著低于WT型小鼠(t=2.520,P=0.0177)。GLT25D1^(+/-)小鼠交配后平均每窝出生的鼠仔数目为4只,低于WT小鼠平均鼠仔数7只(t=-8.482,P<0.001)。结论 GLT25D1基因敲低后会导致GLT25D1-/-胚胎致死,且影响部分GLT25D1^(+/-)小鼠正常出生,GLT25D1^(+/-)小鼠出生后20天体重减轻,繁殖能力下降。

糖基因GLT25D1和GLT25D2缺失对APAP诱导的急性药物性肝损伤的影响

目的 研究糖基因Glt25D1和Glt25D2在对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导的急性药物性肝损伤中的可能作用及机制.方法 抽取6~8周雄性糖基因Glt25D1和Glt25D2敲除小鼠(Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-))及野生型小鼠(Wild type,WT),构建药物性肝损伤模型.实验组腹腔内注射500 mg/kg APAP,对照组给予相同剂量生理盐水.造模6 h后处死小鼠.检测小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,观察肝组织病理.分离提纯小鼠肝原代细胞,分别加APAP和衣霉素(Tunicamycin,Tm)刺激6 h后收取细胞,提取细胞蛋白和RNA.q-PCR、Western印迹检测小鼠肝脏组织及原代肝细胞Glt25D1和Glt25D2、内质网应激相关蛋白、凋亡相关蛋白、炎性因子的表达变化趋势.结果 Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-)造模组小鼠ALT和AST水平均显著高于WT造模组.小鼠肝脏HE染色可见,Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-)造模组小鼠肝损伤程度比WT造模组更严重.Glt25D1^(Δhep) Glt25D2^(-/-) APAP造模组GRP78、chop以及cleaved caspase-12、cleaved caspase-3等内质网应激相关蛋白的表达量高于WT造模组,同时伴有线粒体细胞色素C的释放.结论 Glt25D1和Glt25D2基因敲低加重小鼠APAP诱导的急性肝损伤,促进内质网应激,促进肝细胞凋亡.