GLT25D2基因在对乙酰氨基酚诱导肝毒性损伤中对自噬的调控作用

目的探讨GLT25D2基因在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性损伤中是否对自噬有调控作用。方法选择GLT25D2/野生型C57B/J小鼠和GLT25D2/基因敲除C57B/J小鼠为研究对象。①体内实验：将20只野生型小鼠和20只GLT25D2/小鼠分别按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组和APAP干预组，每组10只。腹腔注射25 /的APAP溶液500 m/g建立小鼠肝毒性损伤模型；PBS对照组腹腔注射等量PBS。制模成功后立即处死小鼠取肝组织，采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测肝组织自噬相关蛋白ATG5、ATG7、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62的表达；电镜下观察肝组织超微结构改变，评估自噬水平。②体外实验：另取野生型小鼠和GLT25D2/小鼠各1只，采用两步胶原灌注法提取原代肝细胞并分为两部分：一部分以5 mmo/ APAP溶液干预0、8、12 h后收集细胞，采用Western Blot试验检测肝细胞自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3、P62的表达；另一部分用绿色荧光蛋白-LC3质粒（GFP-LC3）转染24 h，分别给予PBS（PBS对照组）和5 mmo/ APAP（APAP干预组）温育12 h，荧光显微镜下观察GFP-LC3阳性表达以反映自噬体的形成情况。结果①体内实验结果显示：与相应PBS对照组相比，经APAP干预后，野生型及GLT25D2/小鼠肝组织中自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 -Ⅱ表达下调，而负性相关蛋白P62表达上调，说明APAP处理后自噬整体水平降低。与野生型小鼠相比，GLT25D2/小鼠肝组织自噬正性相关蛋白ATG7、ATG5表达上调（ATG/-actin：1.21±0.29比0.84±0.19，ATG/-actin：1.29±0.14比1.54±0.40，均P〉0.05），LC3 -Ⅱ表达略下调（LC3 -/-actin：0.52±0.06比0.58±0.06，P〉0.05），而负性相关蛋白P62表达下调（P6/-actin：1.13±0.94比1.54±0.40，P〉0.05），说明基因敲除后小鼠自噬表达水平高于野生型小鼠。电镜下观察超微结构显示，与相应PBS对照组相比，经APAP干预后，野生型小鼠肝组织自噬体数量无明显变化，但GLT25D2/小鼠自噬体数量增多。②体外实验结果显示：随APAP干预时间延长，野生型及GLT25D2/小鼠原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7表达逐渐上调，LC3略有波动，而负性相关蛋白P62表达逐渐下调，12 h分别达峰值或谷值，说明APAP刺激细胞自噬表达增强，并呈一定时间依赖性；与野生型小鼠相比，GLT25D2/小鼠12 h原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3 -Ⅱ及负性相关蛋白P62表达上调（ATG/-actin：0.93±0.09比0.74±0.06，ATG/-actin：0.80±0.09比0.65±0.10，LC3 -/-actin：1.35±0.30比1.15±0.20，P6/-actin：0.36±0.02比0.31±0.03，均P〉0.05），说明基因敲除后自噬水平增强。荧光显微镜下观察显示，经APAP干预后，野生型及GLT25D2/小鼠原代肝细胞GFP-LC3阳性细胞均较PBS对照组明显增加；GLT25D2/小鼠GFP-LC3阳性细胞比例明显高于野生型小鼠（0.64±0.08比0.36±0.05，P〈0.05）。 结论GLT25D2是自噬负性调控因子，敲除GLT25D2基因能够增强APAP诱导肝毒性损伤小鼠的自噬水平。