斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。

企鹅珍珠贝GLUT1基因全长cDNA克隆及其对葡萄糖的表达响应

葡萄糖转运蛋白（GLUTs）是能量代谢的关键因子,为了探索GLUT1（glucose transporter type1）在企鹅珍珠贝（Pteria penguin）中的功能,开展了企鹅珍珠贝GLUT1基因的克隆与功能研究。利用RACE技术克隆出企鹅珍珠贝GLUT1基因,并命名为Pp GLUT1。该基因c DNA全长为2 068 bp,编码522个氨基酸,有2个跨膜螺旋区,N端和C端都在胞质侧,分子量为57.226 4 k D,理论等电点为5.17。不同组织荧光定量结果表明,在肠和外套膜中表达量最高,闭壳肌中的表达量显著低于其他组织。0.5 g·m L^-1的高质量浓度葡萄糖注射实验表明,在注射后30 min内,肠Pp GLUT1表达量升高,在30 min之后表达量逐渐降低,注射后第2小时表达量最低。不同浓度葡萄糖注射实验表明,当葡萄糖质量浓度为0.1-0.4 g·m L^-1时,Pp GLUT1表达量逐渐上升;质量浓度为0.4g·m L^-1时,Pp GLUT1表达量最高;大于0.4 g·m L^-1之后,表达量逐渐降低。上述结果表明,企鹅珍珠贝Pp GLUT1主要在肠和外套膜表达,并对葡萄糖注射有表达响应,可能在上述组织的葡萄糖转运过程中发挥作用。

GLUT1基因SNP/G22999T多态位点作为预测HiHiLo对左心室结构和功能影响效果的分子标记的研究

目的:探讨葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1)基因第2内含子上G22999T单核苷酸多态性(SNP)与HiHiLo(living high-exercise high-training low)对递增负荷运动中左心室结构和动态心功能的影响的关联关系。方法:采用关联分析(Association-Study)研究方法,聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,选取72名健康受试者,在模拟海拔2500米高度进行4周低氧训练(低氧暴露10h/d,3次75%VO2max低氧训练/周,共4周)。实验前后,运用二维及Doppler超声心动图技术,分别于HiHiLo前后测量72名受试者在递增负荷全过程中的心脏结构指标、收缩功能指标及舒张功能指标。结果:(1)GLUT1基因SNP/G22999T经扩增、酶切后得到GG、GT和TT三种基因型,符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,具有群体代表性。2)GLUT1基因SNP/G22999T多态位点T等位基因携带者短轴缩短率(SF)减小量、递增负荷实验100W(负荷下ESV减小量和50W、100W负荷下的EDT增加量均明显高于未携带T等位基因者。结论:SNP/G22999T多态位点T等位基因携带者较非携带者对HiHiLo训练更敏感,但将该多态位点作为筛选HiHiLo对左心室结构和功能影响效果的分子标记还需加大样本进一步研究。

GLUT1基因有效siRNA序列的筛选实验研究

目的:设计合成干扰葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制GLUT1基因表达的siRNA。方法:根据人GLUT1 mRNA的序列,设计合成4对不同的针对GLUT1的siRNA,应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂转染293T细胞制作病毒,将4对siRNA转染人舌鳞癌细胞Cal-27,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测GLUT1 mRNA表达;Western印迹法检测GLUT1蛋白表达;18F-FDG检测GLUT1基因干扰后对Cal-27细胞摄取葡萄糖的影响。结果:设计合成的4对siRNA中有2对可有效抑制GLUT1的基因表达以及细胞对葡萄糖的摄取。结论:成功设计合成了针对GLUT1基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断GLUT1表达的siRNA,为进一步应用RNA干扰技术进行GLUT1基因沉默,从而进行肿瘤的基因治疗奠定了实验基础。

过表达CagA对胃癌细胞中GLUT1表达的影响

目的探究幽门螺杆菌(H.pylori)的细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)过表达对胃癌细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达的影响。方法用过表达cagA腺病毒感染人胃癌细胞株AGS和人原代胃癌细胞,免疫荧光检测GLUT1的表达;用过表达glut1慢病毒及其空载体慢病毒感染胃癌细胞株AGS和BGC-823、0.002 mg/L嘌呤霉素筛选,用Western blot、免疫荧光验证稳转细胞株;最后用过表达cagA腺病毒感染过表达GLUT1的稳转细胞株,免疫荧光检测GLUT1与CagA的细胞定位。结果成功建立过表达glut1的稳转细胞株AGS/glut1和BGC-823/glut1,免疫荧光结果显示CagA和GLUT1蛋白主要在细胞膜上表达,且过表达CagA能引起细胞膜上GLUT1蛋白达降低并出现碎片化,且CagA与Glut1在细胞膜上共定位。结论CagA与GLUT1共定位于细胞膜上,破坏细胞膜,抑制GLUT1蛋白的表达。

GLUT1对人结肠癌细胞5-氟尿嘧啶耐药性的调控作用及其机制研究

该研究探究葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)对人结肠癌细胞5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药性的调控作用及其机制。实验收集17例5-Fu化疗敏感结肠癌患者的结肠癌组织及癌旁组织、13例5-Fu化疗耐药结肠癌患者的结肠癌组织和癌旁组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blot法检测结肠癌组织和癌旁组织中GLUT1基因和蛋白的表达水平。采用5-Fu浓度递增间断刺激法诱导建立5-Fu耐药HT-29细胞(HT-29/5-Fu)。体外培养HT-29/5-Fu细胞及其亲本HT-29细胞,MTT法检测5-Fu对2种细胞增殖的抑制作用,RT-qPCR法和Western blot法检测HT-29/5-Fu细胞及其亲本HT-29细胞中GLUT1基因和蛋白的表达水平。将HT-29/5-Fu细胞分为正常对照组(NC)、无义对照质粒组(pRS-scrambled)、GLUT1干扰质粒组(pRS-GLUT1),RT-qPCR法和Western blot法检测各组GLUT1基因和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力变化,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,RT-qPCR法和Western blot法检测MRP1、ABCB1、GST-π、Bcl-2和Bax mRNA和蛋白的表达。该实验显示:(1)5-Fu化疗耐药结肠癌组织中GLUT1基因和蛋白表达水平均较5-Fu化疗敏感结肠癌组织升高(P<0.05);(2)培养24 h或48 h时5-Fu(5~100 pg/mL)对亲本HT-29细胞的抑制率较HT-29/5-Fu显著升高(P<0.05);(3)HT-29/5-Fu细胞中GLUT1基因和蛋白的表达水平较其亲本HT-29细胞显著升高(P<0.05);(4)GLUT1干扰质粒组细胞中GLUT1 mRNA和蛋白表达水平较正常对照组和无义对照质粒组显著降低(P<0.05);(5)GLUT1干扰质粒组48 h细胞吸光度值均较正常对照组和无义对照质粒组显著降低(P<0.05);(6)GLUT1干扰质粒组G_(0)/G_(1)期细胞比例较正常对照组和无义对照质粒组显著升高,而S期细胞比例显著减少(P<0.05);(7)GLUT1干扰质粒组细胞凋亡率较正常对照组和无义对照质粒组显著升高(P<0.05);(8)GLUT1干扰质粒组细胞中MRP 1、GST-π、ABCB 1和Bcl-2 mRNA和蛋白表达较正常对照组和无义对照质粒组显著降低(P<0.05),Bax mRNA和蛋白水平较正常对照组和无义对照质粒组显著升高(P<0.05)。该实验证明,GLUT1基因沉默可增加耐药结肠癌细胞对5-Fu的敏感性,这可能与其调节细胞周期、促进细胞凋亡、抑制结肠癌细胞中耐药相关蛋白表达以及调节Bcl2/Bax凋亡通路有关。

广东汉族人群GLUT1基因rs3754219位点单核苷酸多态性与2型糖尿病遗传易感性研究

目的探讨广东地区汉族人群葡萄糖转运蛋白(glucose transporters 1,GLUT1)基因rs3754219位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)遗传易感性的关系。方法 2011年11月-2014年10月,纳入10所医院确诊为T2DM的1 092例患者为病例组,同期1 092例健康人群为对照组。剔除SNP分型缺失率>20%(37例)和SNP位点均分型失败个体(26例),最终纳入病例组1 067例,对照组1 054例。使用SNPscan TM技术检测两组人群GLUT1基因rs3754219位点的基因型,分析其基因型、等位基因频率和不同遗传模型在两组中的分布差异。结果经年龄及体质量指数校正后,rs3754219位点的等位基因频率、多态性基因型频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在不同遗传模型下两组间比较,差异亦均无统计学意义(P>0.05)。结论广东地区汉族人群T2DM患者遗传易感性可能与GLUT1 rs3754219位点SNP无关。

一个罕见葡萄糖转运体1缺陷综合征家系的遗传学分析

目的对一个罕见葡萄糖转运体1缺陷综合征(GLUT1-DS)家系的致病基因变异位点进行检测并对其进行遗传学分析。方法使用高通量全外显子组及PCR-Sanger检测家系成员的相关可疑突变位点,用I-TASSER生物信息学软件对含突变的蛋白质进行生物信息学分析,并采用PCR及毛细管电泳检测该核心家系成员中突变位点的嵌合比例。结果先证者在2月龄时发生首次抽搐,且具有容貌异常、脑脊液葡萄糖含量较低和脑电图异常等临床特征。先证者及其母亲在SLC2A1基因(NM_006516)检出杂合性无义突变c.988C>T(p.R330X),其母亲突变为新生突变(DNMs),但未产生明显的临床表型;蛋白结构生物信息分析表明p.R330X无义突变所产生的截短蛋白使SLC2A1基因编码的GLUT1蛋白丧失部分功能;嵌合体分析显示先证者及其母亲的嵌合率相近。结论该例GLUT1-DS患者的致病突变基因为SLC2A1基因c.988C>T无义突变,先证者母亲临床表型外显不全的原因可能是因为存在嵌合突变以外的分子病理机制。