粒用高粱glutelin基因的表达与进化分析

高粱glutelin是一种储藏蛋白,存在于水稻、玉米等禾谷类作物的籽粒中,是不溶于纯水、中性的盐溶液或酒精,但溶于稀碱或稀酸的蛋白质总称。为进一步研究高粱glutelin功能,改善籽粒品质提供基础,通过BLAST Phytozome数据库获得高粱glutelin的DNA和氨基酸序列数据,结合生物信息学方法鉴定到SbGLUA1(So⁃bic.001G143700)、SbGLUA2(Sobic.009G017600)、SbGLUB4(Sobic.009G007100)基因,并对高粱glutelin基因家族信息、基因结构、系统进化树、glutelin不同基因型各组织表达以及glutelin蛋白质理化性质、跨膜、二级结构、三级结构、蛋白互作关系进行分析。结果表明,glutelin蛋白大多不是分泌性蛋白,是亲水蛋白且流动性较差,SbGLUB4的二级结构主要是无规则卷曲和α-螺旋。glutelin蛋白结构域分析结果显示,大多蛋白较为保守;高粱glutelin与小麦谷蛋白同源性较高。SbGLUB4为种子专性表达,且随种子成熟度程度的增加而增加;各基因表达在品种间存在差异,IS22204较Laohanye略高;SbGLUA2在种子、穗等多个器官表达。STRING预测互作蛋白显示,SbGLUB4与多个种子储藏蛋白结构基因及调节基因(如MYB和bHLH)互作,而SbGLUA2与DNA解旋酶、重组酶等互作,推测可能是其功能发生了变化。

Status and Perspectives on the Researches of Rice Glutelin Mutants

Rice (Oryza sativa L. ) is one of the model plants for genomics research. As the raising of functional rice breeding for special usage, glutelin mutants play a more and more important role in the functional rice breeding as well as eukaryotic gene expression and regulation research materials. For example, the rice cultivar special for the patients suffering from kidney disease and diabetes could be developed from the rice glutelin mutants. In this paper, current researches on characterization, mutation mechanism and breeding usage of various rice glutelin mutants, especially the low glutelin content cultivars, were all discussed with perspectives on the trends of the glutelin mutant researches in the era of post-genomics.

Charactering protein fraction concentrations as influenced by nitrogen application in low-glutelin rice cultivars

To optimize both grain yield and quality of low-glutelin rice cultivars under N-fertilizer strategies, two-year field experiments involving three low-glutelin rice cultivars（W1240, W1721, W025） and an ordinary rice cultivar（H9405） with five N treatments were carried out to determine the effects of N application rate and genotype on protein fractions contents and Glutelin/Prolamin ratio（Glu/Pro）. The difference of protein fraction concentrations affected by N application rate existed in genotypes. Ordinary rice cultivar had a larger increase in glutlein concentration affected by N application rate than low-glutelin rice cultivars did. Glutelin in H9405 had a increase of 30.6 and 41.0% under the N4 treatment（360 kg N ha^（–1）） when compared with N0 treatment（no fertilizer N） in 2010 and 2011 respectively, while all the low-glutelin rice cultivars showed relatively smaller increases for two years. Variance analysis showed no significant effect of N application rate on glutelin in W1240 and W025 while the effects on albumin, globulin and prolamin were significant in low-glutelin rice. What＇s more, N treatment had no significant i nfluence on Glu/Pro ratios in low-glutelin rice cultivars while a significant increase in Glu/Pro ratio was observed in ordinary rice cultivar. So low-gultelin rice cultivars showed a different pattern from ordinary rice cultivars when influenced by N application rate.

Brassinosteroid and gibberellin coordinate rice seed germination and embryo growth by regulating glutelin mobilization

Seed germination is the beginning of a new lifecycle,and involves many complex physiological and biochemical reactions including seed reserve mobilization in the endosperm and nutrient transport and reuse in the embryo.Although glutelin is a dominant storage protein in rice,its contribution to seed germination and its regulatory mechanisms are mostly unknown.Gibberellin (GA) and brassinosteroid (BR),two major growth-promoting phytohormones,also play positive roles in controlling seed germination.However,how GA and BR interact and coordinate seed germination and facilitate glutelin mobilization remains unclear.In the present study,biochemical and physiological analyses of seed germination indicated that both GA and BR promote seed germination and post-germination growth.Exogenous application of GA restored germination defects caused by BR deficiency or insensitivity.Proteomic and q RT-PCR results showed that the expression of several glutelin proteins and their encoding genes was induced by BR and GA in the embryo.Expression assays suggested that the increased accumulation of glutelin protein in the embryo was due to the accelerated degradation of glutelin by a cysteine proteinase (REP-1) in the endosperm.The breakdown of glutelin in the endosperm showed a strict positive correspondence with the length of the shoot.The GluA2 mutation led to reduced degradation rate of glutelin and defects in seed germination,and the promotion effect of GA on seed germination was weakened in the glua2mutant.In vitro culture assay of rice embryos showed that glutelin mobilization functioned downstream of the GA and BR pathways to promote shoot elongation.These findings suggest a mechanism that mediates crosstalk between BR and GA in co-regulating rice seed germination and embryo growth.

Fine mapping and marker-assisted selection (MAS) of a low glutelin content gene in rice

Rice with low glutelin content is suitable as functional food for patients affected with diabetes and kidney failure. The fine mapping of the gene(s) responsible for low glutelin content will provide information regarding the distribution of glutelin related genes in rice genome and will generate markers for the selection of low glutelin rice varieties. Following an SDS-PAGE screen of rice germplasm from Taihu Valley of China, Japonica selection W3660 is identified to be a novel mutant characterized with low glutelin content. For fine mapping the mutant gene for low glutelin content, F2 and F3 populations were derived from a cross between W3660 and Jingrennuo. SDS-PAGE analysis of the total endosperm protein showed that the low glutelin content trait was controlled by a single dominant nuclear gene. Genetic mapping, using SSRs, located this gene to chromosome 2, in the region between SSR2-001/SSR2-004 and RM1358. The dis- tances of the two markers to the target gene were 1.1 cM and 3.8 cM respectively. By semi-quantitative RT-PCR analysis, the transcripts of GluB4/GluB5 genes located within the region do not change. However, GluB5 gene located proximal to SSR2-001/SSR2-004 was specifically reduced. SSR profiles of seven Japonica varieties were compared with that of W3660 for loci in the relevant genetic region. The markers SSR2-004 and RM1358 were used for marker- assisted selection. The selection efficiencies of SSR2-004 and RM1358 were 96.8% and 92.7% respectively. This provides a standard starting point for the breeding of low glutelin content rice varieties in China.

碱性蛋白酶水解时间对玉米谷蛋白理化性质及抗氧化活性的影响

为探究碱性蛋白酶(alcalase)水解对玉米谷蛋白理化性质及抗氧化活性的影响,对不同水解时间获得的玉米谷蛋白水解物的表面疏水性、二硫键含量、热性能、分子质量分布、抗氧化活性等进行了评价。结果表明:碱性蛋白酶水解对玉米谷蛋白的性质有显著影响,分子质量和二硫键含量显著降低(P<0.05),与玉米谷蛋白相比其水解物具有较高的溶解性、起泡性、乳化性和热稳定性。此外,玉米谷蛋白水解产物具有良好的抗氧化性能,当水解时间为150 min时玉米谷蛋白水解物的DPPH自由基清除为(54.46±1.43)%,羟自由基(·OH)清除率为(74.06±1.49)%,Fe^(2+)螯合力为(86.69±1.35)%。

Rapid improvement of rice eating and cooking quality through gene editing toward glutelin as target

Rice eating and cooking quality(ECQ)is a major concern of breeders and consumers,determining market competitiveness worldwide.Rice grain protein content(GPC)is negatively related to ECQ,making it possible to improve ECQ by manipulating GPC.However,GPC is genetically complex and sensitive to environmental conditions;therefore,little progress has been made in traditional breeding for ECQ.Here,we report that CRISPR/Cas9-mediated knockout of genes encoding the grain storage protein glutelin rapidly produced lines with downregulated GPC and improved ECQ.Our finding provides a new strategy for improving rice ECQ.

酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺优化

为获得优质的核桃蛋白血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备原料及优化其制备工艺,采用连续提取法从脱脂核桃粕中依次分离出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-25种组分蛋白,测定5种组分蛋白的占比及ACE抑制率,以ACE抑制率最大的组分蛋白作为原料采用酶解法制备ACE抑制肽,在筛选出最适酶解用酶基础上,采用单因素试验与响应面试验优化酶解制备核桃蛋白ACE抑制肽的工艺。结果表明:5种组分蛋白中谷蛋白-1占比仅次于谷蛋白-2,且其ACE抑制率最高,以核桃谷蛋白-1为原料,在筛选出胃蛋白酶作为酶解用酶基础上,经工艺优化得到最优的酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺条件为酶解温度46℃、酶解时间6 h、酶用量4.2%(以底物质量计)、酶解pH 1.6,在该条件下所得核桃谷蛋白-1酶解液的ACE抑制率为(50.08±2.34)%。因此,核桃谷蛋白-1经胃蛋白酶酶解可生产ACE抑制活性较高的核桃多肽。

利用分子标记辅助选择培育优良食味、低谷蛋白香粳稻新品系

【目的】选育低谷蛋白新品种是功能性水稻育种的一个重要方向。为满足肾脏病患者对人体健康和稻米品质的需求,迫切需要在育种中加强对功能性和食味品质的协同改良。【方法】以具有低直链淀粉含量基因Wxmp和香味基因fgr的优良食味粳稻品种南粳46与含低谷蛋白基因Lgc1的日本粳稻品种LGC-1杂交、回交,利用与目标基因共分离的分子标记进行跟踪检测并结合田间选择,在BC2F6获得5个新品系。以亲本南粳46和LGC-1为对照,对新品系的农艺、产量、品质性状进行分析。【结果】与LGC-1相比,新品系的谷蛋白含量和可吸收蛋白含量相当,食味品质得到显著提升,且综合性状优良,表现出较高的产量潜力,适宜在江苏不同稻区进行种植。【结论】分子标记辅助选择作为一种快速、准确、有效的方法,与常规育种技术紧密结合,能够显著提高优质、高产、低谷蛋白水稻品种的选育效率。

低谷蛋白半糯型粳稻营养品质与蒸煮食味品质特征分析

【目的】旨在明确低谷蛋白半糯型粳稻品种(系)与半糯型粳稻和普通粳稻营养和蒸煮食味品质性状的差异及各指标间的关系,为健康优质粳稻的选育提供科学依据。【方法】以低谷蛋白半糯型粳稻品系为材料,半糯型粳稻和普通粳稻品种为对照,在相同环境和栽培条件下种植3种不同类型的粳稻品种共16个,测定并分析稻米总蛋白质及各组分含量的差异,同时分析直链淀粉含量、糊化温度、胶稠度等淀粉理化特征的差异,并进一步分析稻米营养与蒸煮食味品质的相关性。【结果】低谷蛋白半糯型粳稻的谷蛋白含量显著低于半糯型粳稻与普通粳稻,醇溶蛋白和清蛋白含量显著高于半糯型粳稻和普通粳稻。低谷蛋白半糯型粳稻的崩解值显著低于半糯型粳稻和普通粳稻,半糯型粳稻的胶稠度与峰值黏度显著高于普通粳稻与低谷蛋白粳稻;低谷蛋白半糯型粳稻的外观、黏度、平衡度、食味值和普通粳稻无显著差异,但显著低于半糯型粳稻。相关性分析结果显示,总蛋白和醇溶蛋白含量与峰值黏度、崩解值、外观、黏度、平衡度、食味值显著负相关,与消减值、硬度显著正相关;而谷蛋白含量的规律则刚好与之相反。【结论】3种不同类型粳稻品种在谷蛋白含量、直链淀粉含量和崩解值上存在差异显著,其中低谷蛋白半糯型粳稻品种具有较低的谷蛋白含量,较高的醇溶蛋白;半糯型粳稻品种具有较低的蛋白质含量、直链淀粉含量、消减值和回复值,较高的胶稠度和崩解值。4个蛋白组分中,醇溶蛋白对米饭食味品质的负影响最大,与米饭的外观、黏度和平衡度极显著负相关。

油牡丹籽粕蛋白质提取工艺优化及其抗氧化活性研究

以经超临界CO_(2)萃取提油后的油牡丹籽粕为原料,研究油牡丹籽粕蛋白质提取工艺、氨基酸组成和抗氧化活性。通过Osborne分级法分离出四种蛋白质,并对清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白及球蛋白提取工艺进行初步优化,采用响应面法分析油牡丹籽粕主要蛋白质清蛋白最佳提取条件,分析四种蛋白质的氨基酸组成。在此基础上,通过DPPH及ABTS自由基清除率评价四种蛋白的抗氧化效果。研究结果表明:油牡丹籽粕清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的最佳提取条件为粉碎度100目,提取温度依次为45、40、50、30℃,提取时间依次为86、100、100、60 min,清蛋白提取率为47.02%。此外,四种蛋白质均为完全蛋白质具有较强的DPPH自由基清除能力及ABTS自由基清除率能力。油牡丹籽粕蛋白是优质蛋白质资源,本研究为油牡丹籽粕综合利用奠定理论基础。

米谷蛋白淀粉样纤维聚集体自组装过程中蛋白质结构演变、功能性质及体外消化性研究

蛋白质自组装形成淀粉样纤维聚集体,是改善和拓宽食品蛋白质功能性质的重要手段。本文研究了pH 2.0和85℃加热不同时间形成的米谷蛋白淀粉样纤维聚集体(RAFA)自组装过程中蛋白质结构演变、黏度和热力学等功能性质,以及RAFA在模拟胃液和小肠液中的消化行为。结果显示,在pH 2.0、85℃条件下,天然米谷蛋白高分子量亚基逐渐水解成12 ku以下的小分子肽。随着加热时间的延长,RAFA的β-折叠构含量从0 h的(22.76±0.49)%增至峰值6 h时的(32.11±0.52)%,表明RAFA的形成是蛋白质先水解后多肽重组聚集的过程。另外,RAFA表现出较高的热稳定性,其放热峰的Tmax值从0 h的(70.34±0.51)℃增至峰值4 h时的(174.55±0.34)℃。体外消化的透射电镜结果显示,热处理6 h和10 h的纤维消化趋势一致,胃蛋白酶消化60 min后,一部分具有分枝状的长纤维被酶解成短小纤维,同时观察到较大的聚集体颗粒。胰酶作用后纤维结构减少,大的聚集体颗粒被酶解为小聚集体颗粒,即RAFA表现出胃蛋白酶抗性。本研究结果为利用蛋白质纤维聚集体构建新型食品提供了理论参考。

米谷蛋白对挤压淀粉复合物结构及性质的影响

以大米淀粉及米谷蛋白为原料,通过双螺杆挤压技术制备了不同比例的大米淀粉/米谷蛋白复合物,利用FTIR、1HNMR、XRD、DSC、快速黏度计、低场核磁(LF-NMR)、流变仪和SEM对复合物的形成机制、结构变化、理化性质以及微观形态进行了表征。结果表明,大米淀粉发生降解、α-1,6-糖苷键断裂,分支化减弱,并与米谷蛋白发生化学相互作用(包括美拉德反应),形成均匀致密的片层微观结构,从而增强对水分子的束缚能力。挤压后复合物表现为较低的热稳定性、结晶特性、糊化特性以及黏弹性。这些特性随着米谷蛋白添加量的提高得到改善,尤其在米谷蛋白添加量(以淀粉质量为基准,下同)为13%时,复合物的相对结晶度由2.10%(米谷蛋白添加量为9%)增加至3.51%(米谷蛋白添加量为13%),峰值黏度增加至376.51 Cp(1000 c P=1 Pa·s),崩解值提升为362.20 Cp,回生值增加至87.14 Cp,剪切应力随之增大,储能模量与损耗模量明显升高。

挤压处理对淀粉-米谷蛋白复合体系回生特性及流变特性的影响

大米淀粉回生老化是限制其应用的主要原因,而挤压协同米谷蛋白处理对其复合体系回生特性的抑制具有明显效果。为明确挤压处理对大米淀粉/米谷蛋白混合体系回生特性的影响,本研究考察了螺杆转速、挤压温度、物料水分质量分数及大米淀粉/米谷蛋白物料比(m/m)对混合体系回生特性的影响规律,并利用快速黏度分析仪、差示扫描量热仪、X射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪、低场核磁共振仪、扫描电子显微镜、激光扫描共聚焦显微镜以及流变仪分析挤压处理延缓混合体系回生的作用机制。结果表明:当螺杆转速为300 r/min、挤压温度为90℃、物料水分质量分数为34%、大米淀粉/米谷蛋白物料比为91∶9时,挤压处理延缓混合体系回生的效果最显著。与未挤压的混合物相比,挤压处理后混合体系的峰值黏度、崩解值、回生值均显著下降(P<0.05),分别由(3005.00±25.00)、(1193.00±6.00)、(164.33±3.51)cP降低至(429.00±5.00)、(213.00±3.00)、(27.05±0.14)cP,相对结晶度由(20.18±0.13)%下降至(2.17±0.43)%,吸热峰消失,峰值强度比值(1047 cm^(−1)/1022 cm^(−1))显著降低至0.43±0.08(P<0.05),微观结构更加均匀致密、保水性增强、剪切应力下降、滞后环面积增大、储能模量G′及损耗模量G″降低,表现出较好的抗回生能力。本研究结果为挤压处理在延缓淀粉/蛋白混合体系回生中的应用提供理论参考。

Protamex酶水解对玉米谷蛋白泡沫性质及结构特性的影响

采用Protamex酶对玉米谷蛋白进行水解,研究不同水解时间对玉米谷蛋白的泡沫性质、表面张力、理化性质、拉曼光谱及静态流变学性质等的影响。结果表明,Protamex酶水解显著改善玉米谷蛋白的溶解性和泡沫性质,在120 min水解物的起泡力最大,是原玉米谷蛋白的2.8倍左右,泡沫稳定性表现良好。此时水解物的表面张力最低、表观黏度最高,所形成泡沫的微观形态细腻均匀、蛋白膜较厚。随着水解时间延长,玉米谷蛋白水解物的平均粒径持续减小、内源荧光强度和表面疏水性逐渐增加,而表面净电荷呈先减小后增加的变化趋势。拉曼光谱分析结果表明适当水解使α-螺旋含量减少、无规卷曲和β-转角含量增高、酪氨酸残基峰强比(I_(850)/I_(830))增强、色氨酸残基峰强比(I_(760))降低,但对β-折叠含量影响较小;长时间水解使无规卷曲含量显著增加,酪氨酸残基峰强比(I_(850)/I_(830))降低。因此,通过限制性水解作用可改变玉米谷蛋白的结构及界面性质、改善其泡沫性质,提高玉米蛋白在食品领域中的潜在利用率。

米谷蛋白及淀粉结构变化对重组米物化性质的影响

利用挤压技术对重组米进行制备,聚焦蛋白质、淀粉双组分体系,对成分结构变化以及物化特性进行分析,旨在为重组米的研究及开发提供理论参考。首先,通过实验室前期优化,设定挤压参数为:螺杆转数280 r·min~(-1),喂料速度15 kg·h~(-1),挤压温度中6个加热区域分别设置为40, 50, 90,100, 20,20℃,物料的水分含量为34%。并模拟粳米比例,将大米淀粉与米谷蛋白以97∶3的比例进行重组米制备,最后利用傅里叶红外光谱等技术对重组米中米谷蛋白与淀粉的结构进行表征,并探讨米谷蛋白与淀粉结构变化,相互影响及作用对引起重组米与天然大米物化性质差异的深层次原因。结果表明:挤压重组米中淀粉的有序结构降低,分支化减弱,导致内部直链淀粉含量增多(直链淀粉由16.37%增加至25.71%)。而米谷蛋白的疏水区域暴露,二级结构发生转变,呈现去折叠化(其中,α-螺旋结构为15.76%,β-折叠结构为42.77%,β-转角结构为21.56%,无规则卷曲为19.91%),肽链延展,与淀粉之间发生缠绕结合,抑制淀粉的重结晶,并通过相互作用促进重组米均匀紧实的结构形成。米谷蛋白及淀粉结构的变化及相互作用导致重组米与天然大米的物化性质大不相同,其中重组米的硬度为25.9 g,弹性为0.90 mm,黏性为7.9 mJ,咀嚼性为0.27 mJ,远低于天然大米,且重组米的颜色较暗(?L=83.97),热稳定性低,糊化温度及回生值降低,吸水性增强,流变性能表现为更明显的黏性性能,弹性性能减弱。

高起泡性玉米谷蛋白水解物对戚风蛋糕品质的影响

目的:为蛋白酶限制性修饰技术在玉米谷蛋白上的应用提供新方向。方法:以玉米蛋白粉为原料,提取玉米谷蛋白,利用响应面法优化碱性蛋白酶及复合蛋白酶水解玉米谷蛋白的酶解条件,探究不同水解物对玉米谷蛋白泡沫性质及其添加量对戚风蛋糕品质的影响。结果:经优化碱性蛋白酶及复合蛋白酶最佳水解条件分别为:pH 8.0、温度60℃、加酶量3%和pH 7.0、温度50℃、加酶量0.81%。水解物的起泡性及泡沫稳定性均升高。当碱性蛋白酶水解物添加量为10%,复合蛋白酶水解物添加量为30%时,戚风蛋糕的质构特性均为最佳,其膨胀度均达最高,硬度及咀嚼性达最低,弹性及回复性达最大。此外,此添加量下其色度与零添加组最为接近。结论:碱性蛋白酶及复合蛋白酶水解可有效提高玉米谷蛋白的泡沫性质,拓宽其在食品行业中的应用。

芥子酸和米糠谷蛋白非共价相互作用的分子机制研究

为探究芥子酸(sinapic acid,SA)与米糠谷蛋白(rice bran glutelin,RBG)的非共价相互作用的动态过程及其分子机制,本文利用荧光光谱法表征了荧光猝灭机制、结合位点数及热力学参数,并进一步通过分子对接结合分子动力学模拟解析了SA与RBG相互作用的动态过程和分子机制。结果表明,SA以静态猝灭的方式猝灭RBG蛋白的内源荧光形成复合物,结合位点数约为1。两者的结合是自发行为,疏水相互作用是主要驱动力。分子对接发现RBG上存在5个潜在结合位点。进一步的分子动力学模拟表明SA不仅稳定结合在C2位点,而且表现出最低的结合自由能,是最可能的结合位点。蛋白质回旋半径、均方根位移和均方根偏差分析进一步证实了SA与RBG结合的稳定性。结合自由能分解和相互作用分析从蛋白和小分子结构两个角度揭示了6个关键氨基酸(Ile131、Ile90、Gln261、Trp149、Tyr151及Tyr102)和SA的甲氧基对SA与RBG的结合具有重要作用。研究结果为SA-RBG复合物作为功能性食品配料的应用开发提供了理论基础。

稻米蛋白质组分及总蛋白质含量与淀粉RVA谱特征值的关系

利用低谷蛋白含量(low glutelin content,LGC)粳稻品种W1721与大面积应用的杂交粳稻恢复系轮回422构建了重组自交系群体。根据种子总蛋白质的SDS-PAGE带型,推断各单株LGC位点的基因型。在排除脂肪的影响下,比较了基因型LGCLGC(谷蛋白含量较醇溶蛋白低)与基因型lgclgc(谷蛋白含量较醇溶蛋白高)在RVA谱特征值上的差异,以及同一基因型内总蛋白质含量与淀粉RVA谱特征值的关系。结果表明基因型LGCLGC的崩解值和回复值的平均值分别显著和极显著大于基因型lgclgc;LGC对崩解值和回复值的相对加性效应分别为3.91%和4.45%,贡献率分别为4.81%和12.81%。LGCLGC型的稻米,总蛋白质含量与崩解值和消减值分别存在显著的负线性回归和正线性回归关系,贡献率分别为9.86%和11.48%;lgclgc型的稻米,总蛋白质含量与消减值和回复值都存在极显著的负线性回归关系,贡献率分别为13.41%和27.88%。结合前人研究认为,稻米食味品质受谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量以及总蛋白质含量的影响;而总蛋白质含量对食味品质的影响因谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量的不同而异。因此,育种工作中应当把谷蛋白相对于醇溶蛋白的含量以及总蛋白质含量同时作为选择指标。