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Advances in the Identification of Genetically Modified Rice with Real-time PCR and Multiplex PCR
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作者 Juan QIU 《Agricultural Biotechnology》 CAS 2017年第3期23-25,29,共4页
In recent years, food security and safety have attracted increasing attention due to the worldwide research and development of genetically modified (GM) rice, and the controversy over the commercialization of GM ric... In recent years, food security and safety have attracted increasing attention due to the worldwide research and development of genetically modified (GM) rice, and the controversy over the commercialization of GM rice. And the identification of GM rice is of great significance. Therefore, in the present study, the po- tential problems in the identification of GM rice with PCR were analyzed both at a technical level and from a theoretical perspective. In addition, PCR detection on the transgenic elements: promoter, terminator, internal reference gene and target gene was discussed, respectively. The possible solutions were proposed based on the principles of plant virology and genetic engineering. 展开更多
关键词 Genetically modified gm rice Qualitative detection PROMOTER TERMINATOR Bt gene multiplex pcr Real-time pcr
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Developing an efficient multiplex PCR method to detect mcr-like genes 被引量:1
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作者 Sheng Lei Jiali Lv +2 位作者 Shuai Gao Swaminath Srinivas Youjun Feng 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2019年第5期705-707,共3页
Dear Editor,Since 2016, a growing number of mobile colistin resistance(mcr) genes have been identified and characterized (Liu et al., 2016). In addition to mcr-1 and its variants, mcr-2 to mcr-8 have now been reported... Dear Editor,Since 2016, a growing number of mobile colistin resistance(mcr) genes have been identified and characterized (Liu et al., 2016). In addition to mcr-1 and its variants, mcr-2 to mcr-8 have now been reported, which reflects a significant threat to public health and agricultural production (Sun et al.,2018). 展开更多
关键词 pcr DEVELOPING an efficient multiplex pcr method to DETECT mcr-like GENES Figure
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转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法 被引量:17
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作者 潘爱虎 张大兵 +3 位作者 潘良文 陈家华 袁政 梁婉琪 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2003年第7期856-860,共5页
利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基... 利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。 展开更多
关键词 转基因抗草甘膦油菜 pcr检测方法 灵敏度 外源基因 检测技术
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多重PCR法检测转Bar、Bt基因双抗稻米 被引量:13
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作者 邱良焱 肖有玉 +5 位作者 刘佳 宋尚新 肖红梅 索娜 王於建 王雪强 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第6期139-142,共4页
旨在建立一种快速、有效的检测转基因双抗稻米的方法,以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料,针对其水稻内源基因SPS和外源基因(包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子)设计多重PCR检测体系。结果表明,应用该多重PC... 旨在建立一种快速、有效的检测转基因双抗稻米的方法,以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料,针对其水稻内源基因SPS和外源基因(包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子)设计多重PCR检测体系。结果表明,应用该多重PCR检测体系可快速检测出原料中的全部6条目标基因,检测灵敏度可达0.9%。 展开更多
关键词 转基因水稻 检测 多重pcr
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荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌多重PCR检测方法的建立 被引量:22
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作者 胡冰雪 舒沿沿 +2 位作者 潘道东 曾小群 吴振 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第20期209-214,共6页
针对肉制品中易污染的荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等有害微生物,通过3种标准菌株及肉制品建立多重聚合酶链式反应方法,实现肉制品中这3种菌的同时、快速检测。利用荧光假单胞菌的gyrB基因、沙门氏菌的invA基因和单增李斯特菌... 针对肉制品中易污染的荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等有害微生物,通过3种标准菌株及肉制品建立多重聚合酶链式反应方法,实现肉制品中这3种菌的同时、快速检测。利用荧光假单胞菌的gyrB基因、沙门氏菌的invA基因和单增李斯特菌的hly A基因设计3对特异性引物,在确定引物特异性的基础上,对3种标准菌株及在冷却肉上过夜富集后进行灵敏度检测。结果表明,该多重聚合酶链式反应方法对于同时检测这3种有害微生物具有高度的特异性;同时检测这3种菌时,纯菌DNA检测限可达1 pg/μL;将3种菌一起接种到冷却肉中35℃过夜培养后,荧光假单胞菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的检测限分别可达到9、5、70 CFU/m L。 展开更多
关键词 多重聚合酶链式反应 检测方法 荧光假单胞菌 沙门氏菌 单增李斯特菌
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同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:12
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作者 施开创 莫胜兰 +3 位作者 张步娴 屈素洁 赵日浪 钟诚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期810-814,共5页
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp... 为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 美洲型病毒株 欧洲型病毒株 多重RT.pcr 检测方法
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应用多重PCR-液相悬浮芯片技术检测转基因水稻品系 被引量:3
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作者 黄文胜 傅凯 +3 位作者 邓婷婷 李富威 刘昊 陈颖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第20期158-163,共6页
开展转基因水稻的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)液相芯片检测方法研究。针对科丰6号(KF6)、科丰8号(KF8)、华恢1号(BT63)、克螟稻(KMD1)、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九种转基因水稻的侧翼序列,设计合成了在... 开展转基因水稻的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)液相芯片检测方法研究。针对科丰6号(KF6)、科丰8号(KF8)、华恢1号(BT63)、克螟稻(KMD1)、M12、T1C-19、T2A-1、LL62和LL601九种转基因水稻的侧翼序列,设计合成了在生物素标记的多重PCR扩增引物与固定在荧光编码微球上的探针,建立了2个多重PCR-液相芯片检测体系,可同时检测出这9种转基因水稻成分。结果表明,9种转基因水稻的引物和探针都具有较高的特异性,各组引物/探针之间无交叉扩增和非特异杂交,且在多重PCR-液相芯片检测中9种转基因水稻品系的相对检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。 展开更多
关键词 多重pcr 液相芯片 转基因水稻 检测
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侵染甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:15
8
作者 李华伟 许泳清 +4 位作者 邱思鑫 刘中华 邱永祥 汤浩 余华 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1464-1470,共7页
为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因(hsp70)及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引... 为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因(hsp70)及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引物筛选,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV 3种病毒的多重RT-PCR检测方法。该体系能有效扩增出大小为304、433、601 bp 3个特异性片段。测序结果表明3种病毒与参考序列的一致性达94%-99%。应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测单一或复合侵染3种甘薯病毒,为甘薯脱毒和病毒病诊断奠定基础。 展开更多
关键词 甘薯病毒 褪绿矮化病毒 G病毒 羽状斑驳病毒 多重RT-pcr 检测方法
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实验动物皮肤病原真菌多重PCR检测方法的建立与初步应用 被引量:3
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作者 邢进 冯育芳 +1 位作者 岳秉飞 贺争鸣 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2015年第12期65-70,共6页
目的建立石膏样毛癣菌(Tm)、石膏样小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴类毛癣菌(Am)的多重PCR检测方法,用于实验动物皮肤病原真菌的快速检测。方法根据Genbank公布的四种皮肤病原真菌的18S-28S rRNA序列设计特异性引物,通过引物、d NTP、... 目的建立石膏样毛癣菌(Tm)、石膏样小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴类毛癣菌(Am)的多重PCR检测方法,用于实验动物皮肤病原真菌的快速检测。方法根据Genbank公布的四种皮肤病原真菌的18S-28S rRNA序列设计特异性引物,通过引物、d NTP、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度和时间的优化,建立四种皮肤病原真菌的多重PCR体系。经特异性和敏感性检验后,对15份人工感染真菌大鼠毛和260份实验动物毛发样本进行检测。结果所建多重PCR方法能够有效区分四种皮肤病原真菌,产生192 bp(Tm)、460 bp(Mg)、290 bp(Mc)和602 bp(As)的目的片段,最低检测限分别为5.9 pg/μL、6.6 pg/μL、9.5 pg/μL和5.1 pg/μL。被检的15份人工感染样本扩增结果准确,260份毛发样本中未检测出四种真菌。结论所建立的多重PCR方法能够同时对实验动物中的四种皮肤病原真菌进行快速的检测,具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 皮肤病原真菌 多重pcr 检测方法 实验动物
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鸡传染性支气管炎的多重RT-PCR检测及793/B血清型的鉴定 被引量:2
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作者 孟凡磊 刁有祥 +4 位作者 张伟 王辉 刘方娜 王妮 马雪杰 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2008年第6期45-48,共4页
【目的】建立鸡传染性支气管炎病毒(IBV)快速、准确的检测方法。【方法】根据GenBank中已经发表的793/B型和多株IBV的N基因和S1基因,对比分析后以N基因的保守序列设计合成了1对引物,跨度为582bp;以793/B的S1基因设计合成了1对特异型引物... 【目的】建立鸡传染性支气管炎病毒(IBV)快速、准确的检测方法。【方法】根据GenBank中已经发表的793/B型和多株IBV的N基因和S1基因,对比分析后以N基因的保守序列设计合成了1对引物,跨度为582bp;以793/B的S1基因设计合成了1对特异型引物,跨度为891 bp;建立了能检测出IBV并能够同时鉴定出793/B血清型的实验室一次性PCR诊断方法。【结果】多重RT-PCR检测表明,793/B血清型可出现582和891 bp 2条核酸片段,而其他血清型只出现582 bp 1条核酸片段,新城疫病毒、传染性喉气管炎、鹅副粘病毒则无任何条带出现。【结论】所建立的TR-PCR方法具有一定的特异性,可用于IBV的快速检测和793/B血清型的临床诊断。 展开更多
关键词 多重RT-pcr 传染性支气管炎 793/B血清型 检测方法
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转基因甜米酒多重PCR检测方法的建立 被引量:1
11
作者 宋尚新 邱良焱 +2 位作者 高峰 周光宏 肖红梅 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第S02期66-70,共5页
建立一种抗除草剂转基因稻米制品的四重PCR检测方法.以抗除草剂转基因稻米SPS(sucrose phosphate synthase,蔗糖磷酸合酶基因)内源基因、CAMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S,花椰菜花叶病毒35S)启动子、Bar(blalaphos resistance,抗... 建立一种抗除草剂转基因稻米制品的四重PCR检测方法.以抗除草剂转基因稻米SPS(sucrose phosphate synthase,蔗糖磷酸合酶基因)内源基因、CAMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S,花椰菜花叶病毒35S)启动子、Bar(blalaphos resistance,抗草丁膦除草剂)外源基因、NOS(nopaline synthase,胆脂碱合酶基因)终止子为模板设计四对引物,通过引物浓度和退火温度的优化建立抗除草剂转基因稻米的四重PCR检测方法,以用于转基因甜米酒的检测.结果表明:建立的四重PCR检测方法快速可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低,可用于市场中抗除草剂转基因稻米及其米制品的快速检测. 展开更多
关键词 转基因检测 抗除草剂 转基因稻米 米制品 多重pcr BAR基因
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转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴式数字PCR定量检测方法的建立 被引量:8
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作者 陈雪娇 宗凯 +3 位作者 孙娟娟 李云飞 郑海松 姚剑 《中国农学通报》 2018年第6期131-136,共6页
为进一步提升转基因水稻的定量检测效率,推动转基因定量标识制度的实施,对转基因水稻品系‘Bt汕优63’成分进行微滴式数字PCR法定量检测研究。基于转基因水稻品系‘Bt汕优63’的外源插入片段和水稻蔗糖磷酸盐合成酶基因SPS,选择、设计... 为进一步提升转基因水稻的定量检测效率,推动转基因定量标识制度的实施,对转基因水稻品系‘Bt汕优63’成分进行微滴式数字PCR法定量检测研究。基于转基因水稻品系‘Bt汕优63’的外源插入片段和水稻蔗糖磷酸盐合成酶基因SPS,选择、设计和合成高效特异性的内外源基因引物探针,用于微滴式数字PCR法扩增‘Bt汕优63’的内源基因和品系特异序列。引物探针优化实验表明,SPS60-F/R/P和‘Bt汕优63’品系基因-F/R/P适用于dd PCR双通道法定量检测‘Bt汕优63’成分。准确度验证试验表明,测得值与标准值相近,偏差分别为0.03、0.15、0.15、0.03。测得值的SD介于0.08~0.48之间,RSD介于4.86%~15.10%之间,小于欧盟要求25%,准确度较好。本研究建立的转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴数字PCR定量检测方法简便高效、准确度高,可用于农产品和食品中转基因水稻‘Bt汕优63’成分的定量检测。 展开更多
关键词 微滴式数字pcr 双通道法 定量检测 转基因水稻 'Bt汕优63’
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猪繁殖与呼吸综合征病毒一步多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:2
13
作者 吴锦艳 田宏 +6 位作者 尚佑军 陈妍 魏衍全 侯相民 赵娜 何建辉 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1485-1490,共6页
本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法。通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒... 本研究旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的一步多重RT-PCR检测方法。通过多序列比对以及反应条件的优化,从4对引物中精选了3对特异性和敏感性较好、扩增片段分别为228、345和490bp的引物,并应用所建立的方法对4种分离株的细胞毒和组织毒、田间样品及临床症状相似的疾病猪瘟和猪伪狂犬病毒做了检测;并对田间及实验室样品进行符合率试验,对阳性样品进行重复性试验。与常规RT-PCR法进行比较,证明该方法比常规RT-PCR法敏感性提高了10倍;而且利用该方法可使检测时间大大缩短;特异性试验证实该方法无交叉反应;阳性和阴性样本的符合率均为100%;3次阳性样品重复性检测结果完全相同;稳定性试验显示该试剂盒至少可保存1年以上。本研究所建立的PRRSV一步多重RT-PCR检测方法的敏感性高、特异性强、操作简便、省时、结果重复性好,不仅适用于临床病例尤其低微含量样品的诊断,而且在筛查隐形带毒动物及兽医检疫方面具有重要的应用价值。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 一步多重RT-pcr 检测方法
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PCR方法在抗虫转基因水稻外源基因漂移风险研究中的应用 被引量:1
14
作者 张富丽 牛蓓 +4 位作者 常丽娟 宋君 王东 尹全 刘文娟 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第10期2269-2274,共6页
本试验以抗虫转基因水稻华恢1号为研究对象,将几种非转基因常规栽培水稻种植在其周围,采用PCR检测方法对不同距离收集的F_1代水稻种子进行转基因杂种鉴定,统计并分析外源基因漂移的频率,评估无标记基因抗虫水稻基因漂移风险。结果显示,... 本试验以抗虫转基因水稻华恢1号为研究对象,将几种非转基因常规栽培水稻种植在其周围,采用PCR检测方法对不同距离收集的F_1代水稻种子进行转基因杂种鉴定,统计并分析外源基因漂移的频率,评估无标记基因抗虫水稻基因漂移风险。结果显示,外源bt基因向P13381和春江063水稻平均漂移频率皆为零。而抗虫转基因水稻华恢1号与非转基因水稻合系22-2、天香、明恢63、P1157几个品种不同程度地发生了转基因漂移,平均漂移频率最高为0.88%,并且漂移频率随着距离加大而逐渐降低,在7 m以外的所有采样点平均转基因漂移频率为零。采用合理田间布局、物理隔离、保持合适距离,以及科学安排农时、错开花期等方式,可有效减小转基因水稻外源基因漂移风险。本试验表明,采用PCR法可以准确地进行转基因杂种的鉴定,但缺点是工作量很大,耗时较长,需进一步寻求更简便高效的方法用于检测无标记基因的转基因漂移频率。 展开更多
关键词 转基因水稻 抗虫性 基因漂移 环境安全 pcr方法
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同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 被引量:2
15
作者 施开创 官家明 +4 位作者 胡杰 李凤梅 莫胜兰 陈汉忠 李军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期453-457,共5页
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经... 为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪其他常见病毒无交叉反应;经典株、变异株、TJM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PPRSV感染的临床样品进行检测,结果显示PRRSV阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、TJM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可以为PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 美洲型病毒株 TJM—F92疫苗株 多重TaqMan荧光定量RT—pcr 检测方法
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多重PCR在瘢痕疙瘩Fas基因突变分析中的应用 被引量:3
16
作者 靳睿 高建华 刘晓军 《中国临床康复》 CSCD 2003年第23期3190-3191,T004,共3页
目的:建立瘢痕疙瘩Fas基因常见突变外显子的多重PCR扩增反应体系,以利进行批量瘢痕疙瘩基因突变的筛选和检测。方法:取正常皮肤、增生瘢痕和瘢痕疙瘩组织DNA样本,根据瘢痕疙瘩Fas基因易发突变的外显子6,8,9之序列,按照多重PCR引物设计原... 目的:建立瘢痕疙瘩Fas基因常见突变外显子的多重PCR扩增反应体系,以利进行批量瘢痕疙瘩基因突变的筛选和检测。方法:取正常皮肤、增生瘢痕和瘢痕疙瘩组织DNA样本,根据瘢痕疙瘩Fas基因易发突变的外显子6,8,9之序列,按照多重PCR引物设计原则,建立3对相应引物,先分别找出各外显子的最佳扩增条件,再进行综合分析,最终找到一个理想的多重PCR扩增条件。结果:各外显子单一扩增片段和多重PCR扩增条带均清晰,产量较高,无非特异性扩增,产物长度与理论值一致;DNA测序证实,各扩增产物即各外显子基因片段。结论:成功建立了瘢痕疙瘩Fas基因常发突变外显子的多重PCR扩增体系,与以往单基因分次扩增相比,实现了一次同时扩增3个基因片段,为瘢痕疙瘩基因诊断和进一步相关的分子生物学研究提供了一个经济、快捷的方法,对于瘢痕疙瘩Fas基因的突变研究具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 pcr 瘢痕疙瘩 Fas基因突变 应用 分子生物学
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A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:7
17
作者 谢守玉 刘惠心 +7 位作者 施开创 赵晶 屈素洁 尹彦文 王树培 陆文俊 冯淑萍 粟艳琼 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期905-911,共7页
为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经... 为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10^2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。 展开更多
关键词 A型塞尼卡病毒 口蹄疫病毒 多重RT-pcr 检测方法
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PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:9
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作者 龙飞翔 施开创 +3 位作者 张珍 尹彦文 陈汉忠 莫胜兰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2518-2526,共9页
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪轮状病毒(PRoV)的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因... 为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪轮状病毒(PRoV)的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×103、1.41×102和1.41×103拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪轮状病毒 多重RT-pcr 检测方法
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基于多重PCR和第二代高通量测序技术快速检测下呼吸道感染病原微生物方法的建立和应用 被引量:12
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作者 郑凯文 黄晓园 +3 位作者 陈渡波 张俊杰 王菊芳 徐鸿绪 《国际检验医学杂志》 CAS 2020年第17期2066-2070,共5页
目的针对引起下呼吸道感染的20种常见病原微生物,建立一种基于多重PCR和第二代高通量测序技术的快速、高通量检测方法AC-seq。方法经生物信息学分析,设计20种下呼吸道感染常见病原微生物特异性引物并通过PCR评估引物的敏感性和特异性。... 目的针对引起下呼吸道感染的20种常见病原微生物,建立一种基于多重PCR和第二代高通量测序技术的快速、高通量检测方法AC-seq。方法经生物信息学分析,设计20种下呼吸道感染常见病原微生物特异性引物并通过PCR评估引物的敏感性和特异性。建立可进行第二代高通量测序技术的多重PCR扩增体系。采集34例临床肺泡灌洗液标本,对检测方法进行初步测试,并与临床培养结果进行对比评估检测效果。结果所有引物均具有良好的敏感性和特异性。在临床标本检测中AC-seq共检出13种病原微生物,培养法检出8种;AC-seq检测阳性率为79.41%,培养法为32.35%,差异有统计学意义(P<0.05)。AC-seq检测灵敏度为100%,与培养法的一致率为50%。检测时间比培养法缩短至少1 d。结论基于多重PCR和第二代高通量测序技术,成功建立了一种检测下呼吸道感染20种常见病原微生物的快速、高通量的方法。 展开更多
关键词 多重pcr 第二代高通量测序 下呼吸道感染 检测方法
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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 苏琦 汤亚飞 +5 位作者 佘小漫 蓝国兵 于琳 吴正伟 李正刚 何自福 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第23期4684-4695,共12页
【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江... 【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份,对采集的样品按照地区和症状进行分类,提取每份样品的总RNA,将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果,设计特异引物进行RT-PCR验证,从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒,根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物,通过优化反应体系和反应条件,建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中,共检测到12种病毒,按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒(Lagenaria sicerariaalphaendornavirus,LSEV)(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒(zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒(watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV)(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒(cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)(3.8%)、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)(1.3%)。78份样品中,复合侵染率高达80.8%,其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物,12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物,引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL,从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种,其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒;复合侵染现象较普遍,以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高;研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术,提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。 展开更多
关键词 蒲瓜 病毒病 小RNA深度测序 RT-pcr检测 多重pcr方法
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