农杆菌介导将雪莲凝集素(GNA)基因转入籼稻单倍体微芽的初步研究

以含有双元载体（携带GNA基因，npt－Ⅱ基因）的根癌农杆菌菌系LBA4404转化籼稻单倍体无性系微芽Hu18，经共培养后在含G418的保存培养基中连续筛选G418抗性芽，抗性芽经生根培养基中壮苗获得单倍体转化植株。PCR分析证明GNA基因已进入到Hu18细胞中，抗虫鉴定表明转基因植株具有白背飞虱抗性。并探明了G418对单倍体微芽的致死浓度和时间，共培养时间对G418抗性芽产生的影响。

转GNA基因小麦新株系的分子检测和抗蚜虫性鉴定

为了进行抗蚜虫转基因小麦的研究,将人工合成的雪花莲凝结素(Galanthusnivlisagglutinin,GNA)基因通过基因枪转入优质小麦品种郑州9405的幼胚愈伤组织,经过在选择培养基上多次筛选,从360块被轰击的愈伤组织中再生到1株Bialaphos(除草剂)抗性植株,命名为G郑州9405。通过连续2代对转化株系进行PCR、Southern检测和蚜虫抗性鉴定,证明GNA基因已经整合到了郑州9405基因组中。目前已经获得了纯合稳定的转基因株系,并在河南农业科学院小麦所进行了环境释放试验。

GNA基因遗传转化甘蔗研究

虫害常常给甘蔗生产造成重大损失。GNA对蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式害虫和某些咀嚼式害虫如蛴螬等有极高的毒性。对引进的GNA基因进行鉴定,并利用基因枪将GNA基因转化甘蔗愈伤组织,经筛选、分化,获得了一批抗性再生植株,抽样检测,获得了4株PCR阳性植株,为培育优良抗虫甘蔗新品种创造了条件。

鸡GNAS基因启动子突变及其与肤色性状的相关性

为研究鸡GNAS基因突变情况及其对乌骨鸡肤色的影响,本试验选择东乡绿壳蛋鸡样本,采用PCRRFLP和DNA测序方法,筛查肤色相关的GNAS突变位点;采用荧光定量PCR方法,检测EDN3、MC1R、GNAS、ADCY3基因的表达量;本试验还对3个鸡种进行了突变检测。结果显示,在家鸡20号染色体的11 167 660碱基位置存在T/C突变,该T2270C突变点是GNAS基因启动子的关键位点。PCR产物经DraI酶切电泳后,CC纯合基因型出现一条342bp的条带;TC杂合基因型出现171和342bp两条带;TT隐性纯合基因型出现一条171bp的条带。3种基因型的肤色L值差异极显著(P<0.01),CC基因型的L值最小,表现为肤色最深;TT基因型的L值最大,表现为肤色浅白。EDN3基因的表达量以CC基因型最高,TT基因型最低,3种基因型间差异极显著(P<0.01)。MC1R、GNAS和ADCY3基因的表达量以CC基因型最高,但基因型间的表达差异均不显著(P>0.05);GNAS与上游MC1R基因的表达量无显著相关性,而与下游ADCY3基因的表达量极显著相关(P<0.01)。江山乌骨鸡、伊莎蛋鸡、东乡×伊莎测交组合鸡的突变分型结果符合理论值(P>0.05)。本研究表明,鸡GNAS基因启动子T2270C突变与肤色性状强相关,突变检测可辅助用于乌骨鸡的肤色分型育种。

雪花莲凝集素基因(gna)的改造及其抗蚜性(英文)

用定点突变方法对编码雪花莲凝集素 (Galanthusnivalisagglutinin ,GNA)前体蛋白的DNA序列进行了改造和转基因烟草 (NicotianatabacumL .)抗蚜性的研究。结果表明 ,将GNA编码序列中含有的稀有密码子改造后 ,GNA的表达水平从占总可溶性蛋白的 0 .17%增加到 0 .2 5 % ,转基因烟草的抗蚜性也随之增强 ,从平均抑制桃蚜 (Myzusper sicae (Sulzer) )虫口密度 6 3.7%显著地提高到 71.0 %。

基因枪法转Bt/GNA基因超甜玉米植株的获得及抗虫性鉴定

以超甜玉米自交系S1幼胚诱导的愈伤组织为受体材料,利用基因枪法共转化Bt和GNA基因,获得了128株再生植株,移栽成活31株,其中26株可育。经PCR检测外源基因整合进玉米基因组中,含Bt基因11株,其中有5株能扩增出GNA基因。Southern杂交证明,目的基因已经整合在玉米基因组中。对9株转基因T1代植株叶片室内接虫抗性鉴定,结果显示,5株转基因植株叶片饲喂6d后明显抑制玉米螟幼虫的发育,幼虫体重增加较少,幼虫死亡率高,表现较强的抗性。

基因枪法介导GNA基因遗传转化甘蔗的研究

目的:将含有雪花莲外源凝集素(GNA)基因的植物表达载体用基因枪法分别导入一个果蔗和一个糖蔗品种中,以期获得转基因植株。方法:将GNA基因插入到植物表达载体上,构建出不同选择标记、不同启动子的表达载体,并用基因枪法将之导入甘蔗胚性愈伤组织,分别在G418、PPT和Hyg的选择压力下,筛选抗性植株,并进行分子杂交鉴定。结果:通过斑点杂交和PCR-Southern杂交证明GNA基因已整合到甘蔗基因组中。结论:用基因枪法成功获得了含有GNA基因的甘蔗转化株,为培育抗甘蔗绵蚜(Ceratovacuna lanigeraZehnther)的新品种提供了基础。

农杆菌介导GNA基因转化菜薹

以菜薹带柄子叶为外植体 ,采用农杆菌介导法将特异启动子PRSs-1与雪花莲凝集素 (GNA)基因构建的嵌合基因转化菜薹 ,获得 2 6株Km抗性植株 ,经过PCR检测和PCR

转GNA+SBTi双价基因抗虫水稻的遗传分析及抗虫性研究

研究了转GNA +SBTi双价基因籼稻的遗传规律及对褐飞虱和稻纵卷叶螟的抗虫实验。分子检测结果表明 :外源基因在R2代株系中发生了分离 ,部分株系分离符合 3∶1或 15∶1的孟德尔遗传规律 ,但也有分离比为 1∶1及其它不正常分离的株系存在。对这些株系的特别追踪发现这几种分离式样在R3代中出现交叉。对R2和R3代转基因植株进行抗虫实验 ,结果表明分别有 83 3%和 76 9%的株系对褐飞虱的抗性较原种对照均有了显著的提高。 78 6 %的R2代株系对稻纵卷叶螟的抗性比原种对照的抗性强 ,且大部分R3代株系继续保持良好的抗稻纵卷叶螟的性质。获得了 9个分子检测阳性率高且对褐飞虱和稻纵卷叶螟抗性增强的水稻株系。

GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗

利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA(植物外源凝集素)活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。

转Bt+GNA双价基因抗虫棉花中抗虫基因及其抗虫性的遗传稳定性

采用PCR和PCR Southern跟踪检测 ,Bt和GNA两个抗虫基因在转Bt+GNA双价基因抗虫棉花TL1的 3个连续世代均稳定存在 ,完全连锁遗传 ;室内棉铃虫生物测定表明 ,该转基因植株的 3个世代都高抗棉铃虫 ,各世代之间抗性水平一致 ,没有显著性差异 ;温室蚜虫抗性试验显示 3个世代均对蚜虫具有较好的抑制作用 ,且抑制效果相当。因而 ,两个抗虫基因在转Bt+GNA双价基因抗虫棉花TL1中能稳定地遗传和表达。

转Bt-CpTI-GNA基因棉花的研究(英文)

采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因(Bt-CpTI-GNA)导入常规棉花品种中,获得转基因再生株,分子检测表明外源基因已在棉花体内表达,并遗传给后代材料。PCR分子检测与转化的标记基因和外源目的基因抗性三者极有规律性。其所携带的基因在转基因棉花中有分离现象,这可能是外源基因整合到受体棉株体内“基因沉默”而引起所致。

GNA基因遗传转化甘蔗研究

虫害常常给甘蔗生产造成重大损失。GNA对蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式害虫和某些咀嚼式害虫如蛴螬等具有极高的毒性。本研究对引进的GNA基因进行鉴定,并利用基因枪将其转化甘蔗愈伤组织,经筛选、分化,获得了一批抗性再生植株,抽样检测,获得了4株PCR阳性植株,为培育优良抗虫甘蔗新品种创造了条件。

鸡GNAS基因c.36-2277T>C突变对萤光素酶表达的影响

为分析探讨鸡GNAS基因ENSGALT00000062075.1:c.36-2277T>C突变对转录调控的影响,本试验选择乌骨鸡和芦花鸡血液样本,构建了c.36-2277T>C突变点的不同基因型质粒,并转染鸡胚成纤维细胞后,检测双萤光素酶报告基因分析系统的表达。结果表明:样本芦花鸡均为TT基因型,乌骨鸡均为CC基因型;c.36-2277T>C突变点的上下游-175～+818 bp片段具有显著增强转录活性作用(P<0.01),且CC基因型活性极显著高于TT基因型(P<0.000 1)。转录因子预测结果表明:此993 bp片段中TGGCA结合蛋白位点数量最多;紧邻突变点分别为AP-1和ER-alpha/T3R-alpha结合位点。研究认为,GNAS基因c.36-2277T>C突变点的碱基类型会对基因转录调控进程产生重要影响,且该突变可能是通过与上下游转录因子结合位点共同作用来发挥效用。

阉割对金华猪甲状腺组织GNAS基因表达的影响

为研究阉割对甲状腺刺激性G蛋白α亚基(GNAS)基因表达的影响,采用SYBR Green荧光定量PCR分析方法,分析60、90和120日龄阉割组与非阉割组金华猪甲状腺组织中GNAS基因的表达水平。结果表明:在3个时期,无论是阉割组还是非阉割组,金华猪GNAS基因的表达水平均是90日龄低于60日龄,而120日龄又高于90日龄;非阉割组60日龄GNAS基因的表达量最高,而阉割组120日龄GNAS基因的表达量最高。阉割组GNAS基因的表达水平在不同的生长阶段均低于非阉割组。结果提示建立的SYBR-Green荧光定量PCR方法可有效地用于GNAS基因的表达分析;阉割会造成猪GNAS基因的表达量下降。

婴儿进行性异位骨化症一例报告

患儿男,6月龄,因“全身多处结节进行性增大4月”入院,腹部皮肤病损病理检查符合钙质沉积症,基因测序检测显示患儿GNAS基因有一个杂合突变,为移码突变,考虑诊断为进行性异位骨化症。

朝鲜鹌鹑GNAS基因表达、克隆及其多态性与羽色的相关性

为了研究朝鲜鹌鹑GNAS基因表达和多态性与羽色的相关性,取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑不同发育时期胚胎翅尖组织,采用Trizol法提取总RNA,实时荧光定量PCR检测GNAS基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育不同阶段和不同羽色鹌鹑胚胎翅组织中mRNA的表达水平;克隆GNAS基因的CDS全序列并进行生物信息学分析;采集孵化至10 d胚胎翅尖组织提取基因组DNA,PCR扩增GNAS基因的特定序列,通过不对称PCR-SSCP方法结合测序确定基因型,分析不同基因型对朝鲜鹌鹑羽色形成的影响。结果表明,胚胎发育8~14 d时,GNAS基因在栗羽鹌鹑胚胎组织中的表达水平极显著(P<0.01)高于白羽鹌鹑胚胎。GNAS基因CDS区开放阅读框长1140 bp,含有14个外显子,编码含379个氨基酸的稳定性亲水蛋白。在朝鲜鹌鹑GNAS基因中检测到2个SNP位点,分别为外显子12区域的g.119221T>A和3′UTR区域的g.121181A>G。栗羽朝鲜鹌鹑的3种基因型(AA、AB和BB)的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑存在极显著差异(P<0.01)。结论表明,朝鲜鹌鹑组织中GNAS基因的表达量高低与其羽色的形成有一定的关系,GNAS基因3′UTR上的g.121181A>G位点突变与朝鲜鹌鹑羽色性状之间具有显著关联性,可作为研究朝鲜鹌鹑羽色的一个候选基因。

GNAS基因新生突变致假性甲状旁腺功能减退症Ia型1例

目的鉴定导致假性甲状旁腺功能减退症(PHP)Ia型发病的GNAS基因突变。方法回顾分析1例PHP-Ia型患儿的临床资料。利用Sanger测序方法对患儿及其父母GNAS基因的13外显子进行检测。疑似致病突变在478例健康对照者中进行筛查,排除非致病性变异。利用深度测序方法对患儿及其父母外周静脉血的DNA进行测序,分析确定致病突变的起源。结果女性患儿,实验室检查结果示低血钙、高血磷及高甲状旁腺素(PTH);体格检查有Albright遗传性骨营养不良(AHO)畸形。临床表现符合PHP-Ia型特征。GNAS基因突变筛查发现1个尚未见报道的,位于6号外显子的错义突变(c.479G>C,p.R160P)。父母及健康对照均者未发现该突变。针对突变所在的GNAS基因6号外显子在患儿及其父母外周静脉血的DNA中进行深度测序,每个样本均获得8 000条左右的序列。患儿父母的所有序列中均筛查到该突变。患儿序列中,3 984条携带G等位基因,4 019条携带C等位基因,两者的数目大致相同。深度测序的结果提示,该突变是来源于母系生殖细胞的新发突变。结论发现一个导致PHP-Ia型发生的GNAS基因新突变(c.479G>C,p.R160P),推测该突变起源于母亲生殖细胞。

GNAS基因突变致2例假性甲状旁腺功能减退症Ⅰa型

目的对2例假性甲状旁腺功能减退症Ⅰa型(pseudohypoparathyroidism typeⅠa,PHP-Ⅰa)患者进行临床特征及GNAS基因分析以提高对此病的认识。方法采集2例PHP-Ⅰa患者及亲属外周血提取DNA后对GNAS基因13个外显子及相邻内含子通过聚合酶链式反应进行扩增,然后进行DNA测序,并选取100名健康对照对新突变位点进行检测。结果病例1为18岁女性,因闭经就诊,具有Albright遗传性骨营养不良症(Albright's hereditary osteodystrophy,AHO)体型及亚临床甲状腺功能减退,但多次查血钙磷均正常。GNAS基因检测发现该患者携带c.715A>G(p.N239D)杂合错义突变,其母也携带该突变,临床表现为假假性甲状旁腺功能减退症(pseudo-pseudohypoparathyroidism,PPHP),该突变曾报道为致病突变。病例2为33岁男性,因反复搐搦就诊,主要表现为AHO体型并低血钙、高血磷、高PTH、亚临床甲状腺功能减退症。GNAS基因检测发现患者及其母携带c.433-2A>G(IVS5-2A>G)杂合剪切突变,该突变位于内含子5的3′端高度保守剪切位点,且在100名健康人群中未检出,人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database,HGMD)未见报道,是新发突变。结论本研究发现1个新的GNAS基因突变,拓宽了对PHP-Ⅰa发病机制的认识。PHP-Ⅰa临床表现多样,易误诊及漏诊,早期识别PHP-Ⅰa相关症状,及早进行GNAS基因筛查有助于本病的诊断及治疗。

GNAS新错义突变导致D/E型短指畸形

目的对我国一个短指家系进行致病基因进行鉴定。方法应用全外显子测序对该短指家系进行基因突变检测,并用Sanger测序对突变位点进行验证。结果该家系共有3名患者,均为短指表型,符合常染色体显性遗传。全外显子检测提示患者均存在GNAS基因(NM_001077488:exon13:c.A1145T:p.D382V)杂合错义突变,Sanger测序验证与全外显子结果一致。结论GNAS基因第13号外显子上c.A1145T杂合错义突变是该短指家系的致病原因。