GnIH基因克隆、表达及对幼龄公兔生殖激素的影响

旨在获得兔促性腺激素抑制素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因,检测其在不同组织和不同发育阶段下丘脑中的表达水平,研究其对幼龄公兔生殖激素分泌的影响。本研究以90日龄健康闽西南黑兔公兔为研究对象,采用RACE技术(rapid-amplification of cDNA ends)从下丘脑组织中克隆出GnIH基因,并对序列进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法(real-time quantitative PCR,qPCR)检测GnIH基因mRNA在90日龄公兔不同组织表达水平(n=5)及11、30、60、90、120、150日龄公兔下丘脑中的表达水平(n=6);连续10 d向80日龄公兔分别注射0、0.5、5和50μg鹌鹑GnIH相关肽(n=10)。第11天早上采集耳静脉血液后,屠宰公兔,采集睾丸组织,分别检测血清中生殖激素浓度(GnRH、FSH、LH、INHB和T)和睾丸组织中睾酮合成相关酶基因(StarR、3β-HSD和p450scc)mRNA的表达水平。结果表明,兔GnIH基因cDNA全长904 bp,包含5′UTR 41 bp, CDS区606 bp, 3′UTR 227 bp,编码201个氨基酸。该基因在90日龄公兔大部分组织中均有表达,其中在下丘脑中表达最高(P<0.001);在11到150日龄公兔下丘脑中,90日龄的表达量最低(P<0.01),90日龄后随着日龄增长其表达量极显著增加(P<0.001)。注射GnIH后,50μg剂量组幼龄公兔的血清睾酮浓度极显著低于对照组和0.5μg剂量组(P<0.001),5μg剂量组睾酮浓度显著低于对照组和0.5μg剂量组(P<0.05),50μg剂量组的LH浓度显著高于对照组(P<0.05);此外,5μg组的p450scc mRNA表达量极显著高于其他处理组(P<0.001),而其他组睾酮合成相关酶基因表达量则差异不显著(P>0.05)。结果提示,GnIH基因可能与LH和睾酮的分泌与合成有关,并参与公兔的生殖发育调控,长期注射高剂量GnIH相关肽会导致公兔对药物不敏感,其具体调控机制还需后续研究。

鸽GnIH基因多态性及其与产蛋性状的关联分析

【目的】探究鸽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因多态性,筛选影响母鸽产蛋性状的显著单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,用于高产母鸽的早期选择。【方法】本试验以78对白羽王鸽为研究对象,根据前期克隆获得的鸽GnIH基因mRNA序列(GenBank登录号:MG589639.1)设计引物,通过PCR扩增和直接测序法检测GnIH基因SNP位点并分型,使用Haploview软件对GnIH基因SNP进行连锁不平衡分析,使用SPSS 22.0软件对GnIH基因多态性与白羽王鸽产蛋性状进行关联分析。【结果】白羽王鸽GnIH基因中共检出7个SNPs,分别位于外显子1(c.59 C>T、c.72 T>A)、外显子2(c.398 G>C)和3′-UTR(c.768 C>T、c.860 G>A、c.909 A>G、c.961 T>C),除c.59 C>T位点偏离Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05),其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);c.768 C>T与c.961 T>C位点呈完全连锁不平衡状态(D’=1,r 2=1),c.860 G>A与c.768 C>T、c.961 T>C位点呈强连锁状态(D’=1,r 2=0.69),其余位点呈弱连锁状态;c.398 G>C位点突变造成了氨基酸性质和mRNA二级结构的改变,该位点与母鸽年产蛋量和初产体重均呈显著相关(P<0.05)。【结论】GnIH基因外显子2上的SNP位点对母鸽产蛋性状有显著影响,可作为母鸽产蛋性能的候选分子标记。

腹腔注射GnIH对瑶鸡卵巢糖代谢的影响

旨在探究促性腺激素抑制激素(GnIH)对瑶鸡卵巢糖代谢的影响。将10只瑶鸡随机分为对照组(0.9%生理盐水)和GnIH组(24.54μg/kg GnIH),每组5只。每天7:00和19:00注射生理盐水或GnIH(100μL/次),连续注射14 d,观察并记录瑶鸡的采食情况;采用实时荧光定量PCR方法对瑶鸡卵巢中糖代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、乳酸脱氢酶B(LDHB)和琥珀酸脱氢酶B(SDHB)mRNA表达量进行检测;采用试剂盒对卵巢中葡萄糖、丙酮酸含量进行检测。结果:与对照组相比,GnIH组注射后1、2、4、8 h,瑶鸡的采食量显著升高(P<0.05),夜间平均采食量极显著升高(P<0.01),卵体比显著下降(P<0.05);GLUT1、GLUT3 mRNA的表达量极显著上升(P<0.01),PK、PFK和LDHA mRNA的表达量显著上升(P<0.05),LDHB和SDHB mRNA的表达量显著下降(P<0.05);丙酮酸含量显著升高(P<0.05)。本试验结果表明,腹腔注射GnIH会增加雌性瑶鸡采食量,引起卵巢糖代谢紊乱,进而导致卵巢发育异常。

鹅不同繁殖时期GnRH和GnIH基因表达和激素浓度变化分析

旨在研究GnRH和GnIH基因和激素在鹅繁殖过程中的重要作用,本研究以产蛋性能差异显著的四川白鹅和溆浦鹅为试验材料,利用Real-time RCR方法检测产蛋前期、产蛋期和休产期两种鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中GnRH和GnIH mRNA的表达量;利用放射性免疫和酶联免疫吸附测定法测定血清中的GnRH和GnIH激素变化情况。结果表明:GnRH和GnIH基因在四川白鹅和溆浦鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中均有表达;产蛋前期和产蛋高峰期的下丘脑和卵巢组织中,四川白鹅的GnRH mRNA表达量显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于溆浦鹅,在产蛋高峰期和休产期四川白鹅GnRH激素浓度也极显著(P<0.01)或显著高于(P<0.05)溆浦鹅,在高峰期和休产期四川白鹅GnRH血清浓度分别为51.13和51.10pg·mL-1,溆浦鹅分别为49.52和49.94pg·mL-1;GnIH在两种鹅的变化比较一致,仅在产蛋高峰期,四川白鹅下丘脑组织中GnIH mRNA表达水平极显著低于(P<0.01)溆浦鹅,而两种鹅之间的GnIH激素在各个时期均无显著差异。这提示随着繁殖阶段的改变,在调控两种鹅产蛋性能的作用过程中GnRH可能较GnIH发挥着更为重要的作用,为进一步研究鹅繁殖分子机制奠定基础。

鸽GnIH和GnRH基因克隆及其在不同繁殖阶段下丘脑中的表达

为研究促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)基因在鸽繁殖不同阶段下丘脑组织中的表达变化,探讨GnIH和GnRH基因与鸽繁殖调控之间的关系,本研究以鸽cDNA为模板扩增GnIH和GnRH基因CDS区序列并进行克隆测序,采用实时荧光定量PCR技术检测了产蛋前、产蛋后及哺乳期鸽下丘脑组织中GnIH和GnRH基因mRNA表达水平。序列分析结果表明,鸽GnIH基因CDS区全长522bp,已提交GenBank,登录号:MG589638,编码173个氨基酸,与已知其他鸟类GnIH同源性达85%以上;鸽GnRH基因CDS区全长276bp,已提交GenBank,登录号:MG589639,编码91个氨基酸,与已知其他鸟类GnRH同源性达80%以上。鸽GnIH前体包含1个GnIH和2个GnIH相关肽(GnIHRP-1、GnIH-RP-2),具有典型的"LPXRF"基序;GnRH前体包含1个信号肽、1个GnRH和1个GnRH相关肽(GAP)。实时荧光定量PCR结果表明,产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量最高,且极显著高于产蛋后和哺育期(P<0.01);产蛋后鸽下丘脑中GnRH基因表达量最高,且极显著高于产蛋前和哺育期(P<0.01);产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量极显著高于GnRH基因(P<0.01),而产蛋后和哺育期鸽下丘脑中GnRH基因表达量极显著或显著高于GnIH基因(P<0.01;P<0.05)。结果表明,GnIH和GnRH基因的表达与母鸽不同繁殖阶段的转变有关,为进一步研究鸽繁殖分子机制奠定基础。

GnIH基因多态性与鹅产蛋和体组成性状的关联分析

为研究促性腺激素抑制激素基因(GnIH)的系列特征,以及其SNP多态性位点对四川白鹅产蛋和体组成等性状的影响,克隆了GnIH基因DNA序列,并与哺乳动物和其他禽类进行生物信息学分析;该基因DNA序列比对到鹅参考基因组序列筛选SNP位点,随后采用Sanger方法直接测序PCR产物的方法,检测四川白鹅群体(208个体)中该基因序列,该序列包含3个外显子和2个内含子,CDS区长522 bp,173个氨基酸的前体蛋白GnIH氨基酸序。通过多重比对分析后,统计该基因在四川白鹅群体中SNP位点的基因型及其频率,进而与鹅产蛋和体组成等11个重要经济性状进行关联分析。获得了3735 bp的GnIH基因DNA序列,遗传进化分析显示,四川白鹅GnIH基因与绿头鸭的序列相似度最高(99%);序列比对到鹅参考基因组序列发现该基存在26个SNP位点;SNP位点基因型频率与性状关联分析结果表明:该基因11个SNP位点(g.811T>C、g.1892T>C、g.1320G>A、g.1809G>T、g.2164C>G、g.1708A>G、g.2164C>G、g.1809G>T、g.1892T>C、g.1929C>A和g.2164C>G)与初产蛋质量、体斜长、颈长、胸宽和胫围等性状显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01),所有SNP位点而与48周产蛋数、64周产蛋数、出生质量、半潜水长、龙骨长、骨盆宽等无显著相关(P>0.05)。四川白鹅GnIH基因序列与绿头鸭亲缘关系最相近;本研究克隆的3735 bp的DNA序列中存在26个SNP位点,其中11个SNP位点可作为四川白鹅初产蛋质量、体斜长、颈长、胸宽和胫围等经济性状的潜在的分子标记之一。

GnIH/GnRH对鸟类排卵的调控作用

鸟类卵泡的发育受下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)轴调控,其中,下丘脑是调控各器官活动的中枢,促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitoryhoromne,Gn IH)和促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑中分泌的两种神经肽,GnRH可以促进垂体中促性腺激素的释放,而Gn IH则起着与其相反的作用,GnIH/GnRH激素在鸟类的排卵调控中起着重要作用。文章对GnIH/GnRH激素的发现、分布、结构、受体以及调控等方面进行了初步探讨。

脂联素及其受体与GnRH和GnIH在皖南花猪下丘脑中的发育性表达及相关性研究

【目的】探讨不同发育时期皖南花猪下丘脑脂联素受体及生殖相关激素表达的发育性变化及其相关性。【方法】选择0,30,45,90,180日龄皖南花猪公、母猪各5头,采集其血清和下丘脑组织,采用ELISA法检测各日龄猪血清中脂联素(Adp)质量浓度和促性腺激素释放激素(GnRH)、促性腺激素抑制激素(GnIH)的活性,用实时荧光定量PCR方法检测猪下丘脑中Adp、脂联素受体1(AdpR1)、2(AdpR2)及GnRH、GnIH mRNA表达量的发育性变化和性别差异。【结果】不同日龄皖南花猪血清Adp与GnRH、GnIH水平均有极显著的发育性变化,其中30日龄猪的脂联素极显著低于其他日龄(P<0.01),而GnRH和GnIH水平极显著高于其他日龄(P<0.01);下丘脑Adp mRNA表达量很低,AdpR1mRNA、AdpR2mRNA在不同发育阶段的表达量相对较为稳定(P>0.05),AdpR1mRNA表达量在各个日龄均显著高于AdpR2mRNA。下丘脑GnRH、GnIH mRNA的发育性变化总体呈下降趋势,刚出生母猪的下丘脑GnRH mRNA表达量显著高于其他日龄(P<0.05)。不同性别比较发现,公猪AdpR1mRNA在0日龄、AdpR2和GnRH mRNA在30日龄显著高于母猪(P<0.05)。血清Adp与GnRH水平呈显著负相关(P<0.05),母猪Adp与GnRH呈显著负相关(P<0.05),母猪下丘脑组织中AdpR1、AdpR2表达量与GnRH mRNA呈负相关。公、母猪的GnRH与GnIH含量均极显著相关(P<0.01)。【结论】在皖南花猪发育过程中,脂联素对下丘脑的调节可能主要通过内分泌方式发挥作用,并由AdpR1介导抑制GnRH的分泌,且抑制作用主要表现在母猪中。

小鼠GnIH基因克隆及生物信息学分析

目的:对小鼠促性腺激素抑制激素(GnIH)基因进行克隆,同时采用生物信息学方法分析其蛋白序列。方法:提取雌性小鼠卵巢总RNA,根据小鼠GnIH基因的开放性阅读框设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增GnIH基因,并对其产物进行鉴定;利用生物信息学软件对GnIH蛋白的结构及功能进行预测。结果:GnIH基因的RT-PCR扩增产物与预期一致,大小为567 bp,测序结果与GenBank已发表序列完全一致;小鼠GnIH蛋白有188个氨基酸,其分子式为C_(926)H_(1483)N_(273)O_(273)S_8,分子量为21 065.11,理论等电点(pI)为9.86,GnIH蛋白的二级结构为alphabeta型,含有6个疏水性较高的区域(临界值2.0)。此外,GnIH蛋白为信号肽蛋白,主要分布于细胞核,具有众多的磷酸化酶位点。结论:小鼠GnIH蛋白为一种疏水性信号肽,在参与细胞信号转导及细胞凋亡调控中发挥重要作用,为其细胞功能研究提供了基础资料。

GnIH对去卵巢兼予雌激素大鼠下丘脑POMC的调节作用

目的:探讨侧脑室微量注射促性腺激素抑制激素(GnIH)对下丘脑阿片-促黑素细胞皮质素原(POMC)蛋白表达的影响。方法:40只雌性SD大鼠建立卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠模型后随机分为对照组(n=20)和实验组(n=20),分别于侧脑室微量注射生理盐水和GnIH 4μl;每组根据注射时间不同分为注射1h、2h、4h、6四个亚组(n=5)。采用蛋白印迹技术检测下丘脑POMC蛋白表达的情况。结果:注射1h、2h、4h,实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。注射6h,实验组大鼠下丘脑POMC蛋白的表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论:侧脑室微量注射GnIH可以抑制下丘脑POMC蛋白的表达。

侧脑室微量注射瘦素对大鼠下丘脑GnIH表达的影响

目的:探讨侧脑室微量注射瘦素对下丘脑促性腺激素抑制激素(GnIH)蛋白表达的影响。方法:10只雌性Wistar大鼠随机分为注射生理盐水6h组和注射瘦素6h组,每组5只大鼠。大鼠去卵巢手术同时给予17β-雌二醇后,分别于侧脑室微量注射生理盐水和瘦素各4μl。采用蛋白印迹技术检测下丘脑GnIH蛋白表达的变化。结果:与注射生理盐水6h组相比,微量注射瘦素可明显降低下丘脑GnIH的表达水平(P<0.05)。结论:瘦素可能通过抑制GnIH的表达发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用。

GnIH对母猪生殖调控的研究

【目的】研究促性腺激素抑制激素(GnIH)mRNA在母猪组织器官中的分布,不同剂量GnIH对母猪卵巢类固醇激素合成和细胞增殖相关蛋白表达的影响,及GPR147与GnRH的形态学关系。从分子、细胞水平和形态学角度,探讨GnIH在下丘脑-垂体-性腺轴对母猪生殖调控的作用机制,丰富神经内分泌学的内容。【方法】以30日龄健康仔母猪为研究对象,采用半定量RT-PCR方法研究GnIH mRNA在母猪24个组织中的分布定位。采集青年母猪卵巢样品,分离卵巢颗粒细胞,研究不同剂量GnIH(10-6、10-8、10-10和10-12 mol·L-1)对体外培养的母猪卵巢颗粒细胞类固醇激素(雌二醇,孕酮)的合成、细胞增殖相关蛋白(cyclin B1,PCNA)表达的影响。取30日龄健康仔母猪下丘脑,制作脑片,采用荧光双标记,激光共聚焦显微镜观察拍照分析GPR147与GnRH的形态学关系。【结果】GnIH mRNA主要在母猪的中枢神经系统中表达,尤其是在间脑表达含量最高。在外周组织,如子宫、卵巢、垂体中也有一定量表达。不同剂量的GnIH作用于体外培养的卵巢颗粒细胞,其中10-6和10-10 mol·L-1 GnIH能极显著地抑制雌二醇的分泌(P<0.01),但不同剂量的GnIH对孕酮分泌的影响并不显著。GnIH能极显著地抑制卵巢增殖相关蛋白PCNA和cyclin B1的表达(P<0.01)。此外,激光共聚焦结果显示GPR147与GnRH在下丘脑室旁核及视前区存在密切联系。【结论】GnIH可在下丘脑水平通过其受体直接作用于GnRH神经元,影响GnRH的合成和分泌,进而在中枢水平调控母猪的生殖活动。在外周生殖器官中,GnIH可通过影响卵巢激素的分泌和细胞增殖相关蛋白的表达参与母猪的生殖调控。

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL~(-1))处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)的表达。结果显示,各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好,形态正常,细胞轮廓清晰,组间死亡细胞数差异不显著(P>0.05);在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升(P<0.05);随着GnIH处理浓度的增加,EdU阳性细胞数所占的百分比降低;在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)基因的相对表达量均下降,在10和100 ng·mL~(-1) GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明,在体外培养的鸭颗粒细胞中,GnIH能使细胞周期阻滞在G2期,并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平,从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。

鹅GnIH受体基因的克隆及组织表达特性研究

为明确促性腺激素抑制激素(GnIH)及其受体RF酰胺相关肽受体(RFRPR)和神经肽FF受体(NPFFR)在鹅不同组织的表达,探讨GnIH及其受体与鹅繁殖调控间的关系,研究通过逆转录PCR方法获取各基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR分析GnIH、RFRPR和NPFFR在产蛋期母鹅的卵巢、输卵管、肾脏、肾上腺、眼球、脊髓、延髓、嗅球、视神经叶、大脑、小脑、垂体、下丘脑共13个组织中的mRNA表达水平。序列分析发现,鹅GnIH的2个受体RFRPR和NPFFR高度同源,氨基酸序列相似性达65.35%,具有相似的跨膜结构。荧光定量PCR结果显示,GnIH前体mRNA的主要表达部位是在下丘脑,且在延髓、脊髓、肾上腺、输卵管和卵巢中也有一定的表达。RFRPR和NPFFR两个受体在有GnIH表达的组织中基本都有表达。结果表明,在鹅中,RFRPR更符合GnIH受体的特征,GnIH及其受体可能从下丘脑-垂体-性腺轴的多个环节对鹅的繁殖行为进行调控。

GnIH在陆川仔公猪泌尿生殖系统及内分泌免疫系统中的分布

【目的】从形态学水平和分子水平探究促性腺激素抑制激素(GnIH)在陆川仔公猪泌尿生殖系统和内分泌免疫系统中的分布情况。【方法】采集30日龄健康陆川仔公猪的睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺,采用免疫组织化学和半定量RT-PCR的方法检测GnIH在其泌尿生殖系统和内分泌免疫系统的分布情况。【结果】免疫组织化学分析结果显示,在睾丸、附睾、附睾管、肾、肾上腺、甲状腺、腭扁桃体、脾、淋巴结、胸腺均有不同数量的GnIH免疫阳性细胞分布。半定量RT-PCR的检测显示,GnIH mRNA除了在甲状腺、脾和淋巴结无表达外,在其余组织均有不同程度的表达。【结论】GnIH在泌尿生殖系统和内分泌免疫系统分布广泛,提示GnIH在生殖、免疫和内分泌等生理过程中可能有重要作用。

GnIH对卵巢摘除术后补充雌激素大鼠下丘脑POMC阳性神经元的影响

目的:探讨促性腺激素抑制激素(Gn IH/RFRP-3)对卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠下丘脑阿片-促黑素细胞皮质素原(POMC)阳性神经元的影响。方法:65只成年雌性SD大鼠,随机选取2只用于免疫荧光多重染色,观察Gn IH/RFRP-3与POMC在大鼠下丘脑神经元的表达;随机选取3只用于免疫共沉淀(Co-IP)实验,检测Gn IH/RFRP-3与POMC的相互作用;余下60只建立卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠模型,模型组随机分成注射Gn IH实验组和生理盐水对照组,每组30只,每组根据注射时间不同分为20、40、60、120、240、360min等共6个亚组,每组5只,采用Western Blot法检测Gn IH/RFRP-3处理对下丘脑POMC表达的影响。结果:免疫荧光多重标记结果显示,Gn IH/RFRP-3与POMC共表达于大鼠下丘脑神经元; Co-IP结果证明,Gn IH/RFRP-3与POMC存在相互作用; Western Blot结果表明,注射Gn IH/RFRP-3后20 min组大鼠下丘脑POMC蛋白表达量显著高于对照组(P <0. 05),注射60、120、240、360 min实验组大鼠POMC蛋白表达量明显低于对照组(P <0. 05)。与20 min实验组相比,60、120、240 min组蛋白表达量依次呈下降趋势,360 min组蛋白表达量有升高趋势但是仍然低于20 min组(P <0. 05)。结论:Gn IH/RFRP-3可直接作用于POMC神经元。

GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞自噬与凋亡的影响

【目的】细胞自噬和凋亡存在着相互制约,p38MAPK信号通路作为细胞凋亡的主要调控通路之一,也对细胞自噬存在促进和抑制的双重作用。已有研究表明,促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞自噬与凋亡均有影响,但作用机制尚不明确。故探究GnIH通过p38MAPK信号通路对猪卵巢颗粒细胞(pGCs)自噬与凋亡的影响及其机理,为解决母猪的产子率以及同期发情等问题提供参考。【方法】从猪卵巢中提取卵巢颗粒细胞,进行体外培养。1、探究GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间:按孵育GnIH时间梯度(0 min、10 min、30 min、60 min、90 min)分组,用Western blot检测猪卵巢颗粒细胞p38与p-p38的蛋白表达量变化;2、验证GnIH对p38MAPK信号通路的影响:按(空白对照、GnIH、p38激活剂(U-46619)、U-46619+GnIH)分组,用Western blot检测p38与p-p38的蛋白表达量变化;3、探究不同浓度GnIH对自噬和凋亡的影响:按(空白对照、10^-6 mol·L^-1 GnIH、10^^-8 mol·L^-1 GnIH、10^-10 mol·L^-1 GnIH、10^-12 mol·L^-1 GnIH)分组,用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化;4、验证不同浓度GnIH通过p38信号通路对自噬和凋亡的影响:将细胞分成6组(空白对照、U-46619、U-46619+10^-6 mol·L^-1 GnIH、U-46619+10^-8 mol·L^-1 GnIH、U-46619+10^-10 mol·L^-1 GnIH、U-46619+10^-12 mol·L^-1 GnIH),用Western blot检测自噬与凋亡标志性蛋白的表达量变化。【结果】1.GnIH孵育10 min后,显著降低p38与p-p38的蛋白表达量(P<0.05),提示,GnIH对p38MAPK信号通路的最佳作用时间为10 min;2.U-46619显著促进pGCs的p38磷酸化水平(P<0.05),GnIH显著抑制pGCs的p38磷酸化水平(P<0.05),提示,U-46619使p38MAPK信号通路活化,GnIH对p38MAPK信号通路的活化有抑制作用;3.当GnIH的浓度为10^-6 mol·L^-1时,pGCs的自噬和凋亡水平显著升高(P<0.05),随着GnIH浓度的降低,pGCs的自噬水平逐渐升高(P<0.05),pGCs的凋亡水平逐渐降低(P<0.05),提示,高浓度GnIH可以促进自噬和凋亡,随着GnIH浓度的降低,自噬水平逐渐升高,而凋亡水平逐渐下降;4.加入U-46619后,GnIH使pGCs的自噬显著上调(P<0.05),并且使pGCs的凋亡显著下调(P<0.05),提示,不同浓度GnIH通过p38MAPK信号通路影响pGCs的自噬和凋亡。【结论】GnIH可能通过抑制p38MAPK信号通路的活化,上调pGCs的自噬,减少pGCs的凋亡。

绵羊GnIH和VIP基因在不同繁殖状态下的表达变化

旨在进一步阐明GnIH和VIP基因在绵羊季节性发情和繁殖调控中的作用。本研究选取短光照(模拟繁殖季节)和长光照(模拟休情期)下成年苏尼特母羊各3只及卵泡期和黄体期的小尾寒羊母羊各3只,同时选取短光照第21天和长光照第3、15、21、42、49天共6个不同光照时间点的成年苏尼特母羊各3只,屠宰后采集其性腺轴组织(下丘脑、垂体、松果体、卵巢、输卵管、子宫体),利用qPCR技术分析GnIH和VIP基因mRNA表达规律。结果表明,GnIH和VIP基因在2个绵羊品种上述各组织中均表达,且在下丘脑中的表达量较高;苏尼特羊下丘脑中2个基因在长光照条件下的表达量均极显著高于短光照条件(P<0.01);在小尾寒羊下丘脑组织中,黄体期VIP基因的表达量显著高于卵泡期(P<0.05),黄体期GnIH基因的表达量稍高于卵泡期,但差异不显著(P>0.05)。由短光照转至长光照时,苏尼特羊下丘脑中GnIH和VIP基因表达上升,至长光照第3天时,2个基因表达均达到峰值,之后呈下降趋势。本研究揭示了GnIH和VIP基因在季节性发情和常年发情成年绵羊性腺轴各组织中的定量表达特征,不同光照条件和不同繁殖时期绵羊下丘脑中这2个基因的表达变化进一步提示了GnIH和VIP基因参与绵羊季节性发情调控和发情时期转换;在短光照转至长光照过程中,GnIH和VIP基因主要在长光照前3 d发挥关键作用。

双酚A对雌性大鼠间脑组织Kisspeptin/GnIH基因表达的影响

目的探索环境雌激素双酚A(BPA)对脑组织新型神经生殖内分泌调节因子Kisspeptin/GnIH基因表达的影响。方法以去卵巢雌性大鼠为动物模型,腹腔给予不同剂量的雌二醇(E2)或BPA后,应用荧光定量PCR法检测BPA或E2对雌性大鼠间脑组织中Kisspeptin、GnIH及其各自受体基因表达的影响。结果 BPA各剂量组及E2处理组均显著降低大鼠间脑内Kisspeptin基因的表达量(P<0.05),而BPA高剂量组及E2处理组则明显升高间脑内Kisspeptin受体GPR54基因的表达量(P<0.01);大鼠间脑内GnIH基因的表达量在BPA低剂量处理组明显下降(P<0.01),而BPA高剂量及E2组无显著变化,各剂量组GnIH受体GPR147基因的表达量亦无显著性改变。结论 BPA能干扰生殖轴中的重要神经肽Kisspeptin及GnIH的表达,并且其干扰作用具有低剂量效应。

GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞系)的凋亡效应及睾酮合成的调节作用。从6~8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平。结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高(P<0.01),表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达。转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高(P<0.01)。与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低(P<0.01)。与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 scc mRNA表达量极显著降低(P<0.01),StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低(P<0.05),17β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异(P>0.05)。综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GnIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用。本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据。