NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

汉族人血小板GP Ⅰ b HPA-2基因多态性与冠心病血瘀证的相关性研究

目的观察GPⅠb HPA-2(Ko^b/Ko^a)基因多态性,在北京河北地区汉族人中各基因型的分布频率,分析该多态性与冠心病、冠心病血瘀证易感性的相关性。方法采用病例对照设计,筛选符合冠心病、血瘀证、健康人入选标准的110例冠心病血瘀证、102例冠心病非血瘀证患者及106例健康对照人群为研究对象,进行中医辨证分型、血瘀证计分,并记录冠脉造影病变支数,采用基因测序技术检测HPA-2基因多态性。结果GPⅠb HPA-2a/2a、HPA-2a/2b、HPA-2b/2b各占90.9%,8.8%和0.3%,所有入选病例中仅有1例表达HPA-2b/2b型;冠心病组和健康对照组、冠心病血瘀证组和冠心病非血瘀证组的基因型构成,冠心病患者不同病变支数基因型构成,冠心病血瘀证各基因型患者的血瘀证计分,各组间比较均无显著性差异(P>0.05)。以是否患冠心病为因变量的二分类Binary Logistic回归分析,校正年龄、性别、体重指数对冠心病的影响后,结果显示HPA-2多态位点基因型与冠心病发病无相关性。结论GPⅠb的HPA-2多态位点不是汉族人冠心病、冠心病血瘀证的独立危险因素。

钙调蛋白抑制剂诱导血小板GPⅠbα酶切的分子机制研究

目的探讨钙调蛋白抑制剂在GPⅠbα酶切中的作用和分子机制。方法取健康志愿者静脉血5份[(10 ml/(人)份],分离得到洗涤血小板3 ml/份,将洗涤血小板分别与Calpain抑制剂、活性氧(ROS)拮抗剂、NAD(P)H氧化酶抑制剂、线粒体ROS拮抗剂或溶剂对照(DMSO)等预孵育,再与钙调蛋白抑制剂W7孵育;流式细胞仪检测GPⅠbα表达、胞内Ca2+和ROS浓度;Western blot检测GPⅠbα酶切产物、Calpain底物talin的酶切。结果W7浓度依赖地引起血小板胞内Ca2+浓度升高,Ca2+平均荧光强度DMSO为52±9,而W7在25、50和100μmol/L时分别为121±17、225±23和308±25;W7浓度依赖地诱导血小板ROS产生,与DMSO比较,W7在25、50和100μmol/L时诱导的ROS相对浓度分别为150±11、209±20和297±18;ROS拮抗剂和Calpain抑制剂单独使用时都部分抑制W7诱导的GPⅠbα酶切,联合使用时则完全抑制W7诱导的GPⅠbα酶切。结论钙调蛋白抑制剂通过活化Calpain和产生ROS共同调控ADAM17介导的GPⅠbα酶切。

血小板膜糖蛋白GPⅠbα拮抗剂的研究进展

血小板膜表面糖蛋白GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物可通过与血管性血友病因子的结合,在止血和血栓的形成过程中发挥重要作用。GPⅠbα拮抗剂能够通过阻断GPⅠbα-vWF的相互作用,抑制血小板在受损血管内皮局部的聚集和黏附,从而抑制血栓形成。因此,GPⅠbα拮抗剂是目前研发新型抗血小板药物的方向之一。现就近年来GPⅠbα拮抗剂在心血管方面的研究进展做一综述。

冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠ b的关系

目的:探讨冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠb的关系。方法:选择经冠状动脉造影确诊的冠心病患者50例(冠心病组)、非冠心病患者30例作为对照(对照组)。应用全血流式细胞术检测血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度,酶联免疫吸附法检测血清瘦素水平。结果:冠心病组血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度均低于对照组(P<0.05);校正收缩压、体质量指数(BMI)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖、2h血糖、空腹胰岛素水平及定量胰岛素敏感指数,冠心病组血清瘦素水平高于对照组(P<0.05);单因素相关分析表明冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈负相关(P<0.05);多元逐步回归分析显示冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈独立负相关(P<0.05);Logistic回归分析显示血清瘦素与冠心病发病呈独立正相关(P<0.05)。结论:冠心病患者表现为高瘦素血症,血清瘦素水平增高可能影响血小板活化,高瘦素血症可能在冠心病的发病中具有重要的作用。

益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物及GPⅠbα表达的影响

目的观察益气活血方及其拆方对出血性血小板病患者凝血酶受体血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合物及其组分GPⅠbα的表达的影响来探讨其配伍规律。方法68例出血性血小板病患者及32例健康人静脉血在静息状态及体外加益气活血方及其拆方中药孵育后,采用流式细胞术检测血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达。结果静息状态时,患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达明显低于健康人;益气活血方及其部分拆方组能使患者凝血酶受体GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα恢复至正常水平;而单味中药组作用不明显;方中的主药黄芪与当归配伍为用,可促进血小板膜糖蛋白的表达。结论益气活血全方及其部分拆方组在受体蛋白水平上调节GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ及GPⅠbα的表达,是其治疗出血性血小板病的疗效机制之一。

血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与脑梗死的关系

①目的 探讨GPⅠb基因VNTR多态性等位基因和基因型在中国青岛地区汉族人群中的分布规律 ,并深入研究这种多态性与脑梗死的关系。②方法 采用病例对照研究 ,选择 10 5例经脑CT或MRI确诊的脑梗死病人作为脑梗死组 ,10 0例健康者作为对照组 ,用PCR法对全部受试者进行GPⅠb基因VNTR多态性检测。③结果 脑梗死组B等位基因频率和BC基因型频率均明显高于对照组 (χ2 =5 .16 2、4 .386 ,P <0 .0 5 )。Logistic回归分析结果显示B等位基因与脑梗死有相关性 (OR =5 .10 ,P =0 .0 4 6 ,95 %CI为 0 .96～ 2 7.15 )。④结论 血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与缺血性脑血管病有相关性 ,B等位基因和BC基因型可能是脑梗死的致病危险因素。

佛波酯诱导血小板黏附受体GPⅠbα酶切的机制研究

目的佛波酯(PMA)能诱导血小板黏附受体GPⅠbα酶切,但分子机制未完全阐明。本研究主要探讨PMA诱导GPⅠbα酶切的分子机制。方法取健康志愿者静脉血,分离得到洗涤血小板。将洗涤血小板分别与蛋白激酶C(PKC)抑制剂、活性氧(ROS)抑制剂、NAD(P)H氧化酶抑制剂、线粒体ROS拮抗剂或二甲基亚矾(DMSO)对照等预孵育,再与PMA孵育。流式细胞仪检测ROS浓度;Western blot检测GPⅠbα酶切产物;用非同位素标记法检测PKC活性。结果 PKC抑制剂BIM和ROS抑制剂二硫苏糖醇(DTT)单独使用时,都能完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切。PMA浓度依赖地诱导血小板ROS产生,PKC抑制剂和NAD(P)H氧化酶抑制剂都能抑制PMA诱导的ROS产生,而线粒体ROS拮抗剂没有抑制作用。BIM抑制PMA诱导的PKC活化,DTT则没有抑制作用。结论 PMA可能通过PMA-PKC-NAD(P)H氧化酶-ROS-ADAM17-GPⅠbα信号通路调节GPⅠbα酶切。

抗β_2GPⅠ抗体/β_2GPⅠ与PLT活化

近年来，血栓性疾病发病率不断上升，严重威胁人类健康和生命，血小板（PLT）活化是血栓形成的始动因素，在血栓形成中起到关键作用。研究发现抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPI）抗体出现在多种血栓性疾病中，常见于抗磷脂综合征，能使体内PLT活化并和纤维蛋白结合，引起PLT聚集，

Toll样受体4增强β2糖蛋白1免疫小鼠B细胞的活化

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在β2糖蛋白Ⅰ(β2GP1)免疫的小鼠中,对B细胞活化过程的影响。方法将C3H/HeN(TLR4正常型)和C3H/HeJ(TLR4缺陷型)2种小鼠随机分为β2GP1免疫组和生理盐水对照组,分别注射β2GP1或等量的生理盐水进行免疫。采用皮下多点注射进行初次免疫,2次腹腔注射加强免疫,最后冲击免疫的方法免疫小鼠。采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GP1抗体的效价;HE染色观察小鼠脾脏生发中心数量及大小的变化;免疫组织化学法观察脾脏生发中心内的CD40配体(CD40L)表达;流式细胞术检测小鼠脾脏B淋巴细胞中共刺激分子CD80和CD86的水平变化。结果经β2GP1免疫后,2种小鼠血清中均出现高效价的抗β2GP1抗体,且C3H/HeN血清效价高于C3H/HeJ小鼠。与生理盐水对照组相比,2种小鼠经β2GP1刺激后,CD40L、CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量均显著增加;但C3H/He J小鼠CD40L,CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量低于C3H/He N小鼠。经β2GP1刺激的小鼠脾脏生发中心,比生理盐水组更大更多,C3H/HeN小鼠的生发中心的数量多于C3H/HeJ小鼠。结论 TLR4增强β2GP1免疫小鼠B细胞的活化。

重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体作为抗磷脂抗体综合征B细胞耐受原的初步探讨

目的:探讨重组人β2糖蛋白1第一结构域二聚体(rhβ2-GP1-DⅠ2)对重组人β2糖蛋白1(rhβ2-GP1)免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞反应的抑制作用。方法:应用固相ELISA方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠产生的抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP1)滴度及anti-β2-GP1产生水平比率;应用ELISPOT方法,检测静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后免疫小鼠脾脏β2-GP1特异性抗体形成细胞(AFC)数量。结果:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2后,与对照组比较,rhβ2-GP1免疫小鼠βanti-β2-GP1滴度明显降低(P<0.01),anti-β2-GP1产生水平比率下降,β2-GP1特异性AFC数量明显减少(P<0.01)。结论:静脉注射rhβ2-GP1-DⅠ2能够抑制rhβ2-GP1免疫小鼠β2-GP1特异性B细胞的反应能力。

血小板糖蛋白GPⅠbα vWF结合域在酵母中的表达鉴定

目的 :实现重组糖蛋白GPⅠbαvWF结合域在巴氏毕赤酵母中的表达。方法 :PCR从重组质粒pcDNA3.1 GPⅠbα中扩增GPⅠbαvWF结合域基因 ,以pPIC9k为表达载体 ,构建包含该目的基因的酵母重组质粒 ,转染毕赤酵母GS115 ,以G4 18筛选抗性克隆 ,甲醇诱导表达 ,SDS PAGE与点印迹鉴定表达产物。结果 :获得编码正确的重组质粒pPIC9k GP30 2 ,电转化GS115 ,以G4 18筛选到阳性克隆 ,诱导表达培养上清进行点印迹 ,结果表明表达蛋白能够与抗GPⅠbα单克隆抗体结合。结论 :获得了表达重组蛋白质GPⅠbαvWF结合域的巴氏毕赤酵母菌株以及重组蛋白质GP30

血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb与冠心病冠状动脉粥样硬化病变严重程度的关系

目的探讨血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、血小板膜Ⅰb(GPⅠb)与冠状动脉粥样硬化病变严重程度的关系。方法 2015年6月至2016年6月选取行冠状动脉造影患者260例,根据冠状动脉造影结果分为正常组(n=60)、单支病变组(n=75)、双支病变组(n=65)、三支病变组(n=60),应用Gensini积分法评价冠心病冠状动脉粥样硬化病变严重程度,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平。采用Pearson相关性分析Gensini积分与冠心病血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平的相关性,多因素Logistic分析影响冠心病冠状动脉粥样硬化发生的危险因素。结果与正常组相比,单支病变组、双支病变组、三支病变组总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、C反应蛋白(CRP)、血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平显著升高(P<0.05);而高密度脂蛋白(HDL-C)、左心射血分数(LVEF)水平下降(P<0.05);且随着冠状病变支数增多,TC、TG、LDL-C、CRP、血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平显著升高(P<0.05),而HDL-C、LVEF水平显著下降(P<0.05)。经Pearson相关性分析,Gensini积分与LDL-C、CRP、Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb呈正相关(P<0.05),与HDL-C呈负相关(P<0.05)。经多因素Logistic分析,LDL-C、Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb是冠心病冠状动脉粥样硬化发生的危险因素,而HDL-C是冠心病动脉粥样硬化的保护因素。结论血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb与冠心病冠状动脉粥样硬化病发生有密切的关系,可为临床无创评价冠心病动脉病变提供新的指导方法。

大剂量乌司他丁在兔常温体外循环中对血小板的影响

目的观察兔常温体外循环（CPB）前应用大剂量乌司他丁对血小板数量和功能的影响。材料和方法20只大耳白兔随机分成2组：乌司他丁组（U组，n=10）和对照组（C组，n=10）。U组在CPB前给予乌司他丁10×10^4U／kg，C组给予等量生理盐水，CPB30min，流量为180—300ml／min，肛温维持在36．5～37．5℃。分别记录CPB前、停机、停机后1h、2h和3h的血流动力学指标，测定血小板计数、血小板粘附率（PAR）和血小板膜糖蛋白GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa的分子数。结果CPB后各时间点两组血小板计数较CPB前显著减少（P〈0．01），同时间点两组间无统计学差异（P〉0．05）。CPB后两组PAR较CPB前显著下降（P〈0．01），同时间点C组PAR下降较U组更明显（P〈0．05）。CPB后两组GpⅠb、GpⅡb、GpⅢa分子数较CPB前显著减少（P〈0．01），停机后逐步恢复，同时间点C组较U组更明显（P〈0．05）。结论CPB后血小板数目减少，膜糖蛋白分子数降低，粘附能力下降。CPB前应用大剂量乌司他丁可减少CPB中血小板膜糖蛋白受体的分解，保护血小板功能。

血小板膜糖蛋白Ⅰb在我国汉族人群中分布的多态性

血小板膜糖蛋白Ⅰｂ（ＧＰⅠｂ）含二条肽链，其中α链（重链）的分子量约１４．３万，β链约２．２万，二链以二硫键联结在一起。ＧＰⅠｂ在止血过程中起重要作用。ＧＰⅠｂ在人群中呈多态性分布，我们旨在研究ＧＰⅠｂ在我国汉族人群中的分布情况。材料和方法１取材并制...

蛇毒蛋白与血小板血栓形成

多种蛇毒蛋白具有与血小板表面整合素、膜糖蛋白Ⅰb(GPⅠb)或血管性血友病因子(VWF)相互作用而影响血栓形成的功能。影响血小板血栓形成的蛇毒蛋白目前分为3类:去整合素、VWF调节蛇毒蛋白及GPⅠb结合蛋白。其中,去整合素具有高效抑制血小板聚集的功能;VWF调节蛇毒蛋白具有体外介导VWF依赖型血小板聚集的功能;而GPⅠb结合蛇毒蛋白又分为2组:GPⅠb激动剂和GPⅠb拮抗剂,分别起诱导血小板聚集与抑制VWF介导的血小板聚集的功能。本文将对上述影响血小板血栓形成的蛇毒蛋白的结构、功能及其在临床上的研究与应用进行综述。

采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体

目的采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞（CTL）表位MHC单链三聚体，为增强HBV特异性免疫提供新方法。方法构建小鼠MHCⅠ类分子（H-2L^d）限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链（Ld）和β2M链（β2-microglobulin，β2微球蛋白）的单链三聚体（HBsAg—SCT）。并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体，以HBsAg和OVA—SCT作为对照，转染293A细胞，包装产生携带HBsAg—SCT，HBsAg和OVA—SCT的重组腺病毒。结果经双酶切和克隆测序鉴定，HBsAg—SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体，通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白。通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg—SCT能与抗-Flag抗体发生反应。结论编码HBsAg—SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建，并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒。

脑出血患者血小板CD42b、CD62p的表达与出血量的相关性

目的探讨脑出血患者不同出血量的血小板CIM2b、CD62p水平及其临床意义。方法采用流式细胞仪技术测定138例脑出血患者的血小板CIM2b、CD62p水平，并分别与正常对照组比较。结果脑出血患者血小板CIM2b的表达量明显低于正常对照组（P〈0、01），血小板CIM2b的表达量与出血量呈负相关（r=-0.386，P〈0．01），血小板CD62p的表达量明显高于正常对照纽（P〈0．01），血小板CD62p的表达量与出血量呈正相关（r=0.467，P〈0.01）。结论脑出血患者急性期存在血小板活化现象，脑出血患者血小板CIM2b、CD62p水平的测定，对估计脑出血患者的出血量与病情有很重要的价值。