NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

oxLDL/β_2GPⅠ复合物与自身免疫背景下AS的关系

在动脉粥样硬化发展过程中,动脉内膜上形成的oxLDL/β2GPⅠ复合物可以释放到循环血液中。在SLE、APS等自身免疫疾病中,可以检测到抗oxLDL/β2GPⅠ复合物的自身抗体,与动脉血栓的形成有高度相关性。本文就自身免疫疾病背景下,对oxLDL/β2GPⅠ复合物的存在、生物学功能及其与动脉粥样硬化关系的研究进展进行综述。

TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

目的:探讨TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:利用荧光定量PCR(Real-timePCR)检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TFmRNA表达,采用试剂盒检测细胞TF活性;利用自制的β2GPⅠ胶联亲和层析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)分析β2GPⅠ与THP-1细胞表面相应受体结合情况;Real-timePCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88、MD-2情况;观察TLR4途径抑制物——紫杉醇是否干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的作用。结果:Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞TF表达显著增加(P<0.05);THP-1细胞表面的TLR4能够结合于β2GPⅠ-Affi-Gel柱;Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2显著升高(P<0.05);紫杉醇(1μmol/L)能够抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应。结论:TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中具有重要作用。

反复自然流产患者检测抗心磷脂抗体及IgA抗β2-GPⅠ的临床意义

目的联合检测反复自然流产患者血清抗心磷脂抗体(ACA)与IgA抗β2-糖蛋白-Ⅰ抗体(抗β2-GPⅠ)水平。方法将102例反复自然流产患者按发生自然流产的时间分为早期流产组(孕周小于12周)57例、晚期流产组(孕周大于或等于12周)45例,另将36例健康经产妇作为健康对照组。采用ELISA法检测血清ACA和IgA抗β2-GPⅠ。结果反复自然流产组ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM阳性率分别为41.1%、12.7%、15.7%,IgA抗β2-GPⅠ阳性率为36.2%,其中早期流产组ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM阳性率分别为40.3%、12.2%、15.7%,IgA抗β2-GPⅠ阳性率36.8%;晚期流产组ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM阳性率分别为42.2%、13.3%、15.5%,IgA抗β2-GPⅠ阳性率35.6%。健康对照组ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM阳性率分别为5.5%、0.0%、2.7%,IgA抗β2-GPⅠ阳性率8.3%。早期流产组、晚期流产组ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM和IgA抗β2-GPⅠ阳性率均显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。而早期流产组与晚期流产组ACA-IgG、ACA-IgA,ACA-IgM和IgA抗β2-GPⅠ阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论反复自然流产患者进行ACA-IgG、ACA-IgA、ACA-IgM和IgA抗β2-GPⅠ检测有助于临床病因的诊断。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用

目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。

oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物调节A7r5表型转化及脂质转运分子表达

目的探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab complex)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A7r5)表型转化和细胞表面脂质转运分子的影响,以及toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路在其中的作用。方法分别用oxLDL、oxLDL/β2GPⅠ复合物、oxLDL/抗β2GPⅠ抗体复合物、β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物、oxLDL/β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物刺激A7r5,收集总RNA和蛋白质,利用实时定量PCR、western blot及免疫荧光染色等方法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、巨噬细胞表面标志CD68、半乳糖凝集素3(galectin-3,LGALS3)、B类清道夫受体3(CD36)和ATP结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter)A1/G1(ABCA1/ABCG1)的表达情况;用TLR4阻断剂TAK-242(5μmol/L)或c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinases 1/2,JNK 1/2)阻断剂SP600125(90 nmol/L)预处理的方式,观察TLR4及下游信号分子在oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物诱导A7r5表型转化和脂质转运分子表达变化的作用。结果 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物明显上调细胞CD68和LGALS3水平,降低α-SMA表达,而TAK-242能够反转该现象;oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物能够促进细胞表达CD36,同时抑制ABCA1/ABCG1表达,TAK-242和SP600125能够逆转该过程。结论 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物促进A7r5细胞向"巨噬样"细胞发生表型转变,调节脂质转运相关分子的表达,增强脂质向细胞内转运的能力;TLR4和JNK1/2与该过程密切相关。

钙调蛋白抑制剂诱导血小板GPⅠbα酶切的分子机制研究

目的探讨钙调蛋白抑制剂在GPⅠbα酶切中的作用和分子机制。方法取健康志愿者静脉血5份[(10 ml/(人)份],分离得到洗涤血小板3 ml/份,将洗涤血小板分别与Calpain抑制剂、活性氧(ROS)拮抗剂、NAD(P)H氧化酶抑制剂、线粒体ROS拮抗剂或溶剂对照(DMSO)等预孵育,再与钙调蛋白抑制剂W7孵育;流式细胞仪检测GPⅠbα表达、胞内Ca2+和ROS浓度;Western blot检测GPⅠbα酶切产物、Calpain底物talin的酶切。结果W7浓度依赖地引起血小板胞内Ca2+浓度升高,Ca2+平均荧光强度DMSO为52±9,而W7在25、50和100μmol/L时分别为121±17、225±23和308±25;W7浓度依赖地诱导血小板ROS产生,与DMSO比较,W7在25、50和100μmol/L时诱导的ROS相对浓度分别为150±11、209±20和297±18;ROS拮抗剂和Calpain抑制剂单独使用时都部分抑制W7诱导的GPⅠbα酶切,联合使用时则完全抑制W7诱导的GPⅠbα酶切。结论钙调蛋白抑制剂通过活化Calpain和产生ROS共同调控ADAM17介导的GPⅠbα酶切。

冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠ b的关系

目的:探讨冠心病患者血清瘦素水平变化及其与血小板膜GPⅠb的关系。方法:选择经冠状动脉造影确诊的冠心病患者50例(冠心病组)、非冠心病患者30例作为对照(对照组)。应用全血流式细胞术检测血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度,酶联免疫吸附法检测血清瘦素水平。结果:冠心病组血小板膜GPⅠb阳性百分率及平均荧光强度均低于对照组(P<0.05);校正收缩压、体质量指数(BMI)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖、2h血糖、空腹胰岛素水平及定量胰岛素敏感指数,冠心病组血清瘦素水平高于对照组(P<0.05);单因素相关分析表明冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈负相关(P<0.05);多元逐步回归分析显示冠心病患者血清瘦素水平与血小板膜GPⅠb平均荧光强度呈独立负相关(P<0.05);Logistic回归分析显示血清瘦素与冠心病发病呈独立正相关(P<0.05)。结论:冠心病患者表现为高瘦素血症,血清瘦素水平增高可能影响血小板活化,高瘦素血症可能在冠心病的发病中具有重要的作用。

抗β_2GPⅠ抗体/β_2GPⅠ与PLT活化

近年来，血栓性疾病发病率不断上升，严重威胁人类健康和生命，血小板（PLT）活化是血栓形成的始动因素，在血栓形成中起到关键作用。研究发现抗β2糖蛋白Ⅰ（β2GPI）抗体出现在多种血栓性疾病中，常见于抗磷脂综合征，能使体内PLT活化并和纤维蛋白结合，引起PLT聚集，

血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与脑梗死的关系

①目的 探讨GPⅠb基因VNTR多态性等位基因和基因型在中国青岛地区汉族人群中的分布规律 ,并深入研究这种多态性与脑梗死的关系。②方法 采用病例对照研究 ,选择 10 5例经脑CT或MRI确诊的脑梗死病人作为脑梗死组 ,10 0例健康者作为对照组 ,用PCR法对全部受试者进行GPⅠb基因VNTR多态性检测。③结果 脑梗死组B等位基因频率和BC基因型频率均明显高于对照组 (χ2 =5 .16 2、4 .386 ,P <0 .0 5 )。Logistic回归分析结果显示B等位基因与脑梗死有相关性 (OR =5 .10 ,P =0 .0 4 6 ,95 %CI为 0 .96～ 2 7.15 )。④结论 血小板膜糖蛋白GPⅠb基因VNTR多态性与缺血性脑血管病有相关性 ,B等位基因和BC基因型可能是脑梗死的致病危险因素。

hβ_2GPⅠ第一功能区基因单体和二串联体的克隆和表达

目的:构建h2βGPⅠ(h2βGPI)第一功能区基因单体及二串联体的原核表达载体PQE30-β2GP-ⅠDI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,并在大肠杆菌M15中进行高效表达。方法:应用PCR技术扩增hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体β2GPⅠ-DI,并根据同尾酶特性构建hβ2GPⅠ第一功能区基因二串联体β2GPⅠ-DI2,将获得的单体和二串联体分别与PGEM-T easy载体连接测序,测序正确后分别克隆于原核表达载体PQE30中,构建成重组表达载体PQE30-β2GPⅠ-DI和PQE30-β2GPⅠ-DI2,在大肠杆菌M15中以l mmol.L-1IPTG诱导蛋白表达,经Western blotting鉴定目的蛋白的抗原性。结果:表达了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的蛋白,相对分子质量约为9 000和17 000,其表达量均可达菌体总蛋白的25%,并具有hβ2GPⅠ的抗原性。结论:成功构建了hβ2GPⅠ第一功能区基因的单体及二串联体的原核表达载体,并诱导了蛋白的高效表达。

佛波酯诱导血小板黏附受体GPⅠbα酶切的机制研究

目的佛波酯(PMA)能诱导血小板黏附受体GPⅠbα酶切,但分子机制未完全阐明。本研究主要探讨PMA诱导GPⅠbα酶切的分子机制。方法取健康志愿者静脉血,分离得到洗涤血小板。将洗涤血小板分别与蛋白激酶C(PKC)抑制剂、活性氧(ROS)抑制剂、NAD(P)H氧化酶抑制剂、线粒体ROS拮抗剂或二甲基亚矾(DMSO)对照等预孵育,再与PMA孵育。流式细胞仪检测ROS浓度;Western blot检测GPⅠbα酶切产物;用非同位素标记法检测PKC活性。结果 PKC抑制剂BIM和ROS抑制剂二硫苏糖醇(DTT)单独使用时,都能完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切。PMA浓度依赖地诱导血小板ROS产生,PKC抑制剂和NAD(P)H氧化酶抑制剂都能抑制PMA诱导的ROS产生,而线粒体ROS拮抗剂没有抑制作用。BIM抑制PMA诱导的PKC活化,DTT则没有抑制作用。结论 PMA可能通过PMA-PKC-NAD(P)H氧化酶-ROS-ADAM17-GPⅠbα信号通路调节GPⅠbα酶切。

β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物抑制oxLDL介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK活化

目的探讨β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(β2/aβ2)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)介导的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和黏着斑激酶(FAK)活化的影响,以及Toll样受体4(TLR4)在该过程中的作用。方法用PMA(100 ng/mL)将THP-1细胞诱导为THP-1巨噬细胞。用RPMI 1640培养液、oxLDL、oxLDL+β2/aβ2和oxLDL+脂多糖(LPS)处理THP-1巨噬细胞,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脂质转运相关分子ACAT1、ABCA1和ABCG1的mRNA水平;利用Trinder法检测THP-1巨噬细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)含量,并计算胆固醇酯(CE)含量和其占TC的比例;利用免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FAK的蛋白质和mRNA表达并采用western blot检测其磷酸化;最后,利用TLR4阻断剂TAK-242(1μg/mL)预处理的方式,观察TLR4对上述过程的影响。结果β2/aβ2复合物能够抑制oxLDL引起的THP-1巨噬细胞脂质蓄积和FAK表达与磷酸化,阻断TLR4可以部分逆转这一现象。结论β2/aβ2可以抑制oxLDL引起的巨噬细胞的脂质蓄积和FAK活化,该过程与TLR4有关。

2型糖尿病视网膜病变与血清CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ水平的相关性分析

目的分析2型糖尿病(T2DM)视网膜病变(DR)与血清趋化因子样受体1(CMKLR1)、糖化血红蛋白(HbA1c)及β2-糖蛋白Ⅰ(β2-GPⅠ)水平的相关性。方法于2020年1月至2020年12月间采用简单随机抽样方法抽取淮安市淮安区基本公共卫生服务项目在管的488例T2DM患者进行社区随访和体检,按照是否发生DR分为DR组、非DR组,各244例。统计、对比两组临床资料、常规实验室指标及血清CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ水平。分析两组临床指标与血清CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ的相关性。分析T2DM DR的影响因素。结果DR组空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿酸、收缩压、心率、CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ均大于非DR组,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)小于非DR组,差异均有统计学意义(P<0.05);两组其他临床指标差异均无统计学意义(P>0.05)。经Pearson相关分析,收缩压、CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ与视网膜出血数量、出血面积、出血最大面积、渗出数量、渗出面积、渗出最大面积等DR指标均呈正相关(P<0.05)。行Logistic回归分析,结果表明高水平CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ是导致T2DM DR的独立危险因素。结论T2DM患者血清CMKLR1、HbA1c、β2-GPⅠ水平与DR的发生具有较高的预测价值,3者与DR的发生均呈正相关,且均是导致T2DM DR的独立危险因素。

GPⅠa基因G873A、C807T位点在心脑血管疾病和糖尿病患者中的多态性分布

目的了解阿司匹林药效相关血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A和C807T位点在心脑血管疾病及糖尿病患者中的多态性分布状况。方法收集2018年9月—2020年10月铜陵市人民医院进行阿司匹林药效相关基因位点检测的患者811例,其中心血管疾病患者106例(心血管疾病组)、脑血管疾病患者597例(脑血管疾病组)、糖尿病患者108例(糖尿病组)。采用焦磷酸测序法测定3个组GPⅠa基因G873A、C807T位点多态型。结果单个病例GPⅠa基因G873A、C807T位点野生型、杂合突变型和纯合突变型均同步出现,杂合突变型、纯合突变型合计为47.17%~53.27%,等位基因A、T均为24.53%~31.48%。糖尿病组2个基因位点纯合突变型为13.89%,高于心血管疾病组(1.89%)和脑血管疾病组(8.21%);杂合突变型为35.19%,低于心血管疾病组(45.28%)和脑血管疾病组(45.06%);基因型分布与心血管疾病组、脑血管疾病组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。3个组等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。3个组不同性别患者比较,2个基因位点基因型和等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)。将所有患者按年龄分为29~60岁、61~70岁、71~80岁、81~94岁4个年龄亚组,4个年龄亚组2个基因位点基因型和等位基因分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论阿司匹林药效相关GPⅠa基因G873A、C807T位点在心脑血管疾病和糖尿病患者中的基因多态性分布与性别、年龄无关,2个基因位点突变现象较为常见,突变存在个体间差异,可能影响临床抗血小板治疗效果。糖尿病患者2个基因位点纯合突变率高于心血管疾病患者和脑血管疾病患者。

2型糖尿病微血管并发症患者血清miR-152,β_(2)-GPI/ox-LDL和β2-GPⅠ-Lp(a)水平联合检测的价值研究

目的探讨血清miR-152,β_(2)-糖蛋白I氧化低密度脂蛋白复合物(β_(2)-GPI/ox-LDL)和β_(2)-糖蛋白I脂蛋白a复合物[β_(2)-GPⅠ-Lp(a)]水平联合检测对2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)微血管并发症(type 2 diabetes associated microvascular complications,T2DMC)的诊断价值。方法选取经临床确诊的T2DM患者79例,T2DMC患者78例及体检健康者78例,应用实时荧光定量PCR技术检测血清miR-152的水平,ELISA法检测血清β_(2)-GPI/ox-LDL和β_(2)-GPⅠ-Lp(a)水平,评价上述指标单独或联合检测对于T2DMC的诊断价值。结果血清miR-152,β_(2)-GPI/ox-LDL和β_(2)-GPⅠ-Lp(a)在T2DM患者中分别为44.99(25.71,77.97)fmol/L,0.574(0.376,1.040)U/ml和0.536(0.198,1.056)U/ml,T2DMC患者分别为65.27(43.7,118.1)fmol/L,0.829(0.591,1.138)U/ml和0.597(0.186,1.139)U/ml,均高于健康对照组[13.68(8.14,21.63)fmol/L,0.497(0.196,0.677)U/ml和0.156(0.078,0.476)U/ml],差异有统计学意义(U=616~2192,均P<0.05)。ROC曲线显示,血清miR-152,β_(2)-GPI/ox-LDL和β_(2)-GPⅠ-Lp(a)对T2DMC诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.899(95%CI:0.847~0.950),0.785(95%CI:0.716~0.855)和0.718(95%CI:0.637~0.798);三者联合检测对T2DMC的AUC为0.963(95%CI:0.934~0.992)。Spearman秩相关分析显示,血清miR-152,β_(2)-GPI/ox-LDL和β_(2)-GPⅠ-Lp(a)组合与LDL水平呈正相关(r=0.188,P<0.05)。结论血清miR-152联合β_(2)-GP1-ox-LDL,β_(2)-GP1-Lp(a)对于T2DMC诊断具有较高的灵敏度和特异度,可有效弥补单指标检测不足,是T2DMC潜在的辅助诊断标志物。

血小板糖蛋白GPⅠbα vWF结合域在酵母中的表达鉴定

目的 :实现重组糖蛋白GPⅠbαvWF结合域在巴氏毕赤酵母中的表达。方法 :PCR从重组质粒pcDNA3.1 GPⅠbα中扩增GPⅠbαvWF结合域基因 ,以pPIC9k为表达载体 ,构建包含该目的基因的酵母重组质粒 ,转染毕赤酵母GS115 ,以G4 18筛选抗性克隆 ,甲醇诱导表达 ,SDS PAGE与点印迹鉴定表达产物。结果 :获得编码正确的重组质粒pPIC9k GP30 2 ,电转化GS115 ,以G4 18筛选到阳性克隆 ,诱导表达培养上清进行点印迹 ,结果表明表达蛋白能够与抗GPⅠbα单克隆抗体结合。结论 :获得了表达重组蛋白质GPⅠbαvWF结合域的巴氏毕赤酵母菌株以及重组蛋白质GP30

活性氧在Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导中性粒细胞外诱捕网产生中的作用机制研究

目的探讨活性氧(reactive oxygen species,ROS)在抗β2糖蛋白Ⅰ(β2 GlycoproteinⅠ,β2GPⅠ)抗体/β2GPⅠ通过相关信号转导通路诱导中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成中的重要作用.方法提取健康志愿者中性粒细胞,PBS刺激作为PBS组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ(10/100μg/mL)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制剂(DPI 20μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activatedprotein kinase,MAPK)抑制剂(SB20358010μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抑制剂(U012610μmol/L)刺激作为anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)(50 nmol/L)刺激作为PMA组.流式细胞仪检测中性粒细胞ROS的释放;Western blot检测中性粒细胞p38MAPK、ERK活化.结果与anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组相比,anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组、anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组活性氧释放百分率减少,且anti-β2 GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组抑制作用更明显[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组:(35.21%±1.22%)比(1.62%±0.08%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组:(35.21%±1.22%)比(10.21%±0.98%),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组:(35.21%±1.22%)比(8.36%±0.62%),P<0.05)].Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组、anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组分别使p38 MAPK、ERK磷酸化水平下降(anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+SB203580组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:[(0.601±0.031)比(1.212±0.132),P<0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+U0126组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(0.107±0.001)比(1.612±0.096),P<0.05)],而anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组p38 MAPK、ERK磷酸化水平均无明显下降[anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.198±0.068)比(1.212±0.132),P>0.05;anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ+DPI组比anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ组:(1.682±0.091)比(1.612±0.096),P>0.05].结论健康志愿者中性粒细胞受anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ刺激形成NETs的过程依赖于相关通路(p38MAPK、ERK)的活化及ROS的释放.p38MAPK、ERK为激发ROS释放的上游信号通路.

血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb与冠心病冠状动脉粥样硬化病变严重程度的关系

目的探讨血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、血小板膜Ⅰb(GPⅠb)与冠状动脉粥样硬化病变严重程度的关系。方法 2015年6月至2016年6月选取行冠状动脉造影患者260例,根据冠状动脉造影结果分为正常组(n=60)、单支病变组(n=75)、双支病变组(n=65)、三支病变组(n=60),应用Gensini积分法评价冠心病冠状动脉粥样硬化病变严重程度,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平。采用Pearson相关性分析Gensini积分与冠心病血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平的相关性,多因素Logistic分析影响冠心病冠状动脉粥样硬化发生的危险因素。结果与正常组相比,单支病变组、双支病变组、三支病变组总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、C反应蛋白(CRP)、血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平显著升高(P<0.05);而高密度脂蛋白(HDL-C)、左心射血分数(LVEF)水平下降(P<0.05);且随着冠状病变支数增多,TC、TG、LDL-C、CRP、血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb水平显著升高(P<0.05),而HDL-C、LVEF水平显著下降(P<0.05)。经Pearson相关性分析,Gensini积分与LDL-C、CRP、Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb呈正相关(P<0.05),与HDL-C呈负相关(P<0.05)。经多因素Logistic分析,LDL-C、Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb是冠心病冠状动脉粥样硬化发生的危险因素,而HDL-C是冠心病动脉粥样硬化的保护因素。结论血浆Lp-PLA2、MIP-1α、GPⅠb与冠心病冠状动脉粥样硬化病发生有密切的关系,可为临床无创评价冠心病动脉病变提供新的指导方法。