内含埃博拉病毒GP基因序列假病毒粒子的构建及应用

目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) GP基因序列的假病毒粒子,针对EBOV GP基因建立实时荧光定量PCR检测方法。方法:人工合成GP基因序列,克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-GP质粒。将重组质粒转染293T细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV GP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV GP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。

斯氏副柔线虫GP基因的克隆、抗原表位预测及生物信息学分析

试验旨在克隆斯氏副柔线虫糖蛋白(glycoprotein,GP)抗原基因,并对其进行生物信息学分析。提取斯氏副柔线虫组织RNA,反转录合成cDNA,设计特异性引物以扩增GP基因CDS区,同时将其插入到克隆载体pMD19-T后测序,并对该基因编码蛋白的抗原表位、理化性质、信号肽、跨膜结构域等进行生物信息学预测。结果表明,GP基因开放阅读框(ORF)全长1 149bp,编码382个氨基酸,其分子式为C1760H2878N458O590S1760,理论分子质量约为40.15ku,等电点为4.37,无信号肽,总平均亲水性为0.032,不稳定系数为42.43,是疏水、不稳定蛋白;其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上;二级结构分析显示,斯氏副柔线虫GP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主,与三级结构预测结果一致;抗原表位预测表明,GP蛋白可能有6个B细胞抗原表位和8个T细胞抗原表位,有望用作免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。本研究成功克隆了斯氏副柔线虫GP基因,同时进行了系统的生物信息学分析和抗原表位预测,为斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法的建立和DNA疫苗的研究提供理论依据。

A、B、J亚群禽白血病病毒混合感染的鉴定及gp85基因序列分析

【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组织接种DF-1细胞进行病毒分离,通过PCR、ELISA及间接免疫荧光试验(IFA)等方法进行亚群鉴定,进一步对分离株gp85基因的相似性和变异情况进行分析。【结果】剖检结果可见病死鸡肾脏、脾脏肿大,肺脏出血,表面可见灰白色肿瘤结节;组织匀浆接种DF-1细胞后,ELISA检测发现细胞上清P27抗原呈阳性;IFA检测发现,感染细胞里有特异性绿色荧光;PCR鉴定能同时扩增出A(692 bp)、B(847 bp)和J(545 bp)亚群的特异性条带。鉴定结果表明,从该病死鸡中分离到A、B和J亚群ALV毒株,分别命名为HBYC2022-A、HBYC2022-B和HBYC2022-J。分离株gp85基因核苷酸相似性分析显示,HBYC2022-A与江苏株JS-A1201相似性最高,为99.6%;HBYC2022-B与江苏株JS-B1204相似性最高,为99.7%;而HBYC2022-J与黑龙江株PK19FA01、广西株GX20YL12 J及安徽株AHaq02相似性均为100%。此外,分离株gp85基因高突变区域(hr1、hr2)氨基酸序列并未出现特殊点突变。【结论】鸡群存在A、B和J不同亚群ALV的混合感染情况,提示国内养禽场需提高警惕并加强针对ALV各亚群的流行病学调查。

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp 85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为90.5%~95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%~99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp 85基因片段长度为1008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为89.4%~92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%~99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp85蛋白氨基酸序列均会发生突变,但高变区hr1和hr2所占比例较多,证实了gp85的高变性。在gp85蛋白B细胞抗原表位中存在部分位点的氨基酸突变,可能导致gp85蛋白抗原性发生变化。间接免疫荧光鉴定结果显示,5株分离毒株均可在DF-1细胞内复制并存在可被抗体识别的p27抗原表位。结果表明,本试验分离的7株ALV毒株是国内ALV-J和ALV-K流行毒株的突变株,不仅丰富了ALV基因组库资源,且为后续研究ALV的遗传变异特征和流行趋势等提供参考依据。

龙岩地方品种鸡精液ALV-J检测与gp85基因分析

为掌握龙岩地方品种鸡精液中的J亚型禽白血病病毒(ALV-J)感染率与流行毒株的分子特性,对龙岩地方品种鸡128份精液样本进行p27抗原ELISA检测及ALV-J gp85基因PCR检测。结果表明,17.2%的样本呈现p27抗原阳性,而gp85基因PCR检测确认5.5%的样本含有ALV-J。进一步基因序列分析,发现这些毒株与J亚群参考毒株间的高度同源性,核苷酸序列相似度为92.0%~97.9%,特别是与广西株GX14YYA-J3的相似度高达96.5%~97.9%。通过种鸡精液ALV-J检测与gp85基因分析,为该地区鸡种的疾病防控提供了科学依据。

广西壮族自治区1株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因的遗传变异分析

[目的]了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变异情况。[方法]利用PRRSV实时荧光RT-PCR试剂盒(通用型)对采集自广西壮族自治区某猪场临床发病猪只的肺脏组织样本进行PRRSV检测;利用PRRSV美洲型经典株与类NADC30 PRRSV毒株双重实时荧光RT-PCR试剂盒对样本进行进一步鉴定;采用PCR法扩增GP5基因,将测序获得的核苷酸序列与GenBank数据库中下载的国内外PRRSV参考株GP5基因核苷酸序列进行同源性比对,并构建系统遗传进化树;对GP5基因推导的氨基酸序列进行比对分析。[结果]经鉴定,该份样本呈类NADC30 PRRSV阳性,命名为GXYL株;GP5基因核苷酸序列同源性分析显示,GXYL株与国内外PRRSV参考株同源性为61.9%~93.2%,与美国NADC30毒株的同源性最高,与欧洲型LV毒株的同源性最低;遗传进化树分析显示,GXYL株与美国NADC30毒株以及中国类NADC30毒株位于同一分支,亲缘关系较近,与其他美洲型毒株同处一个大的分支;GP5基因推导的氨基酸比对分析显示,GXYL株共有7个位点发生变异,其中,2个突变位点位于A表位处,1个突变位点位于B表位处,4个突变位点位于信号肽区域,未发现有氨基酸的插入及缺失。[结论]GXYL株为类NADC30 PRRSV毒株,提示该地区应加强对PRRSV流行及变异情况的监控。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CHsx1401株GP5蛋白基因的生物信息学分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的结构和功能进行探究,本研究对PRRSV当前流行株CHsx1401的GP5蛋白基因进行生物信息学分析。结果显示,CHsx140株GP5蛋白基因全长603 bp,编码200个氨基酸;分子质量为22 152.89 Da,理论等电点为8.276,不稳定性系数为37.54,属于稳定的疏水性蛋白;信号肽预测显示GP5蛋白在第1~31位氨基酸处存在信号肽;亚细胞定位预测GP5蛋白主要分布于内质网;跨膜螺旋结构预测显示GP5蛋白存在2个跨膜螺旋结构域;且其存在30个O-糖基化位点和39个磷酸化位点;抗原性分析显示GP5蛋白柔韧性差,表面可及性区域少,有多个抗原指数较高区域;GP5蛋白二级结构中以α螺旋为主。氨基酸同源性和序列比对结果显示PRRSV CHsx1401株GP5的氨基酸与NADC30株的同源性最高,与HUN4株同源性最低,且CHsx1401株GP5蛋白存在多个氨基酸突变位点;GP5蛋白基因系统进化分析显示CHsx1401株与NADC30株位于同一个分支,遗传距离最近,与QYYZ株遗传距离最远。本研究对PRRSV CHsx1401株GP5蛋白基因进行生物信息学分析,为进一步研究PRRSV GP5蛋白的结构和功能提供参考。

猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力

通过分子克隆技术构建了表达猪白细胞介素(IL)-15及猪繁殖呼吸综合症(PRRSV)病毒GP5基因重组核酸疫苗。以小鼠为试验模型,利用猪IL-15作为分子佐剂并检测其对表达PRRS病毒GP5基因核酸疫苗的免疫增强作用。结果表明,猪IL-15与GP5试验组小鼠抗体水平和T淋巴细胞亚群数量均高于PBS对照组及GP5基因单独免疫组,表明猪IL-15对核酸疫苗可有效增强PRRS病毒GP5基因的免疫效果,证实了其佐剂效应。

山东五大地方鸡禽白血病病毒主要流行亚型鉴定及其分离株gp85基因的分子特征分析

通过对山东五大地方鸡(寿光鸡、芦花鸡、百日鸡、琅琊鸡、鲁西斗鸡)不同亚型禽白血病病毒(ALV)分离株鉴定及gp85基因序列分析,探究山东五大地方鸡ALV的主要流行亚型及gp85基因分子特征。分别将寿光鸡、百日鸡、芦花鸡的无菌抗凝血和琅琊鸡、鲁西斗鸡的卵白接种CEF培养9~10d,常规方法提取感染细胞的cDNA,用针对J亚型ALV(ALV-J)gp85基因(924bp)的引物和A^J(含囊膜蛋白env基因,2 400bp)的群引物进行PCR扩增、克隆、测序并分析其特点。本研究发现,2009—2011年间,山东五大地方鸡均存在ALV-J感染,5个ALV-J分离株gp85基因之间的相似性为98.4%~99.9%,与原型毒株HPRS-103相似性为97.8%~98.3%;均扩出内源性ALV(ALV-E)片段,与不能产生传染性病毒粒子的ev-1、ev-3、ev-6毒株相似性最高,推测为鸡基因组所携带;同时还发现,琅琊鸡、芦花鸡存在A亚型ALV(ALV-A)的感染。研究结果表明,2009—2011年间的山东五大地方鸡已经普遍存在ALV-J,两大品系中存在ALV-A和ALV-J共感染,同时ALV-E的片段广泛存在,这一结论揭示出山东地方鸡的禽白血病净化工作更加具有挑战性。

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。

黄羽鸡J亚群禽白血病病毒的分离及gp85基因分析

为了解禽白血病病毒在黄羽鸡中的流行情况,采用DF-1细胞接种、细胞培养上清P27抗原检测、PCR扩增,对送检疑似禽白血病的黄羽鸡病料进行了病毒分离,并对分离病毒gp85基因进行了测序和序列比较.结果表明,自黄羽鸡分离到2株J亚群禽白血病病毒（ALV-J）,分别命名为AHaq01和AHaq02,它们之间的核苷酸序列同源性为93.8％,与ALV-J参考毒株序列同源性为91.1％～99.8％,其中与ALV-J原型毒株HPRS-103的序列同源性分别为93.3％和98.1％,与分离株AHaq01和AHaq02同源性最高的分别是WN100404（95.0％）和SD09TA04 （99.8％）.进化分析进一步表明,2个分离株间的亲缘关系较远,为来源不同的ALV-J毒株.

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

不同地区海兰褐蛋鸡中J亚群-禽白血病病毒株gp85基因的分子演化分析

本研究通过对不同地区海兰褐蛋鸡群中分离的5株J亚群-禽白血病病毒(ALV-J)的囊膜糖蛋白基因(gp85)进行同源性分析,阐述了不同海兰褐鸡群中存在的ALV-J的分子演化规律。对2008-2009年分别从北京、陕西、山东泰安、济阳、曲阜等不同地区饲养的海兰褐鸡分离到的5株ALV-J,用PCR方法克隆gp85基因、测序,并与国内外已发表的14株ALV-Jgp85基因进行同源性比较。结果表明,5株ALV-J与来自白羽肉鸡的HPRS-103株的同源性最近,平均为96.6%(96.4%～96.8%);与来自国内海兰灰蛋鸡的SD07LK1株的同源性平均仅为89.6%(89.3%～89.9%);而5株ALV-J间的同源性高达98.1%以上(98.1%～100%)。本研究发现,不同地区的海兰褐蛋鸡中广泛存在的ALV-J可能有一个共同的来源,即国外的白羽肉鸡。

A亚群禽白血病病毒QC6281株的分离与gp85基因序列分析

本试验通过病理剖检、接种DF-1细胞、ELISA及RT-PCR检测,从北京某种鸡场的疑似禽白血病的父母代蛋鸡中分离到1株A亚群禽白血病病毒,命名为QC6281。并根据GenBank中已发表序列设计引物,扩增env基因片段并将其克隆到pMD19-T-simple载体中,扩增的env基因片段大小为1 239 bp,其中包括完整的gp 85基因,将gp 85基因亚克隆到pMD19-T-si mple载体中并测序,gp 85基因大小为1 032 bp,编码344个氨基酸。将env基因片段和推导的氨基酸序列与GenBank中9株ALV的env基因相应序列做同源性分析并制作进化树图谱。发现QC6281与已发表的A亚群禽白血病病毒株该区域核苷酸同源性在83.8%～98%,氨基酸同源性在86.9%～98.5%。其中与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)同源性最高,核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为98.5%;且与Myeloblastosis-associated virus type 1(L10922.1)亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病性研究打下基础。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

从芦花鸡分离的J亚群ALV病毒及其gp85基因演化

采用RT-PCR方法直接从芦花鸡肿瘤中进行禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）的核酸扩增,经测序证实为ALV。将上述病料接种DF1细胞（C/E）进行盲传,并对其感染细胞上清进行ALV P27抗原检测,结果为阳性,证实获得了一株病毒,命名为SDJN2012。用PCR方法扩增其囊膜蛋白gp85基因并测序,与GenBank中的ALV参考毒株进行核苷酸或氨基酸同源性比较。结果表明：SDJN2012与山东较早发现的J亚群ALV代表株SD0001的核苷酸（氨基酸）同源性最高,达93.4%（92.6%）,与J亚群不同年代的代表株同源性为88.6%～93.3%（88.2%～90.6%）,而与A,C,D,E亚群ALV毒株的同源性仅为19.7%～32.2%（10.2%～32.2%）,进一步确证分离到的病毒为J亚群ALV。对种蛋的跟踪监测证实：ALV蛋清P27抗原阳性率为37.6%,而血清学监测则呈现多样性的变化：鸡群发病前J亚群ALV抗体检测为阴性,发病后阳性率仅为9.35%,而A/B亚群阳性率则由发病前的9.8%,攀升到发病后的75.4%,彰显出ALV病原学、血清学和分子流行病学的复杂性。

J亚群禽白血病JL-2株gp85基因的克隆与表达

本实验在分离鉴定J亚群禽白血病JL_2株的基础上,利用PCR方法扩增出包括gp85基因在内的长度为960bp的DNA片段。将其连到PGEX_6p_1载体上,构建了重组表达质粒PGEX_6P-1/gp85,对质粒进行序列分析并在IPTG的诱导下进行表达。SDS_PAGE分析结果表明,融合蛋白(54 Ku)在BL21中得到有效表达。表达产物占菌体总蛋白的31.8%。Western Blot结果表明,表达产物可与ALV_J阳性血清发生特异性反应。这些结果为进一步研究gp85蛋白的功能及研制ALV_J ELISA诊断试剂盒奠定了基础。

J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立

为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析表明,重组蛋白gp85具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,该方法对其它相关的禽类病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均低于13%,具有良好的重复性。对458份临床血清样品进行检测,同时用IDEXX的同类ELISA抗体检测试剂盒进行对比,总符合率达到96.29%。本研究为ALV-J的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆及分析

为深入探讨J亚群禽白血病病毒(AvianleukosisvirussubgroupJ,ALV J)的亚群特性,利用ALV Jgp85基因两侧的序列片段为引物,从正常SPF蛋鸡、商品肉鸡和DF1细胞基因组中完整地扩增了内源性类ALV Jgp85基因。肉鸡和DF1细胞内源性类ALV Jgp85基因同源性达99 9%;SPF蛋鸡内源性类ALV Jgp85基因与肉鸡和DF1细胞的内源性类ALV Jgp85基因之间同源性达95 6%、95 3%。三种不同来源的内源性类ALV Jgp85基因DNA与IMC10200株ALV J的gp85基因的同源性分别为91 8%、94 1%、94 0%;与ALV J原型株HPRS 103gp85基因的同源性分别为95 6%、98 3%、99 9%。内源性类ALV Jgp85序列与外源性ALV Jgp85基因具有相似或一致的ORF和Jameson Worlf抗原表位优势。

微小隐孢子虫子孢子表面抗原基因gp23的克隆和测序

目的 对微小隐孢子虫子孢子表面蛋白CP2 3编码区基因gp2 3进行克隆及测序。 方法 提取牛源微小隐孢子虫卵囊基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增编码CP2 3的基因 ,然后将其克隆到 pMD1 8 T载体中 ,用双脱氧链末端终止法测DNA序列。 结果与结论 获得了CP2 3的编码区基因 ,克隆出的 gp2 3基因的核苷酸与氨基酸序列长分别为 345bp和 1 1 4aa,有一个开放阅读框 ,与GenBank报道的 gp2 3基因比较 ,同源性分别为 97.3 %与 98 2 % ,在 2 32～ 2 38bp处多了 6bp。