表达PRRSV GP2a-GP4的重组LCMV的构建与鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是危害养猪业发展的重要病原之一。高效PRRS疫苗的研发是病毒防控的重要前提。借助机体产生针对病毒颗粒表面糖蛋白(glycoprotein, GP)GP2a/GP4的中和抗体,阻止与CD163受体的结合,成为PRRSV疫苗研发的关键策略之一。据此,构建了基于重组淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)的反向遗传学操作系统,使重组LCMV携带PRRSV GP2a-GP4蛋白的基因序列。对比P2代和P16代重组病毒的生长曲线发现P16代病毒增殖速度更快、滴度更高。在重组LCMV感染的细胞中,通过Western blot试验能够检测到GP2a-GP4蛋白的表达。该重组LCMV载体的免疫保护效果有待攻毒保护试验的进一步评估。

PRRSV GP2a胞外区的原核表达及免疫原性分析

为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒pET-32a-eORF2,转化宿主菌Rosetta(DE3),并用1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。SDS-PAGE结果表明,重组的GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36000;将包涵体纯化、复性后,以50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,三免后,抗体效价达1∶102400;这表明GP2a胞外区成功表达,且具有良好的免疫原性。

东方市鱼鳞洲崩塌隐患治理工程GPS2型主动防护系统技术应用

本文是GPS2型主动防护网技术应用于山体滚石治理工程的一个具体案例,文章着重介绍了工程施工过程中防护系统网构件的选用、工程布置及施工参数的设计、工程施工工艺、施工安全措施、工程质量检测(抗拔试验数据分析)。工程竣工后,通过多年的观测,工程质量未发生破坏或失效,治理效果明显,充分证实了该项技术应用于边坡滚石治理具备优越性、可行性,值得大力推广。

GPS2对肝癌细胞系MHCC-97H增殖、迁移与侵袭的调控作用

目的探索G蛋白通路抑制因子2(G protein pathway suppressor 2,GPS2)对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭的调控作用及分子机制。方法在肝细胞癌(HCC)细胞系MHCC-97H中,使用定量PCR或Western blot检测HCC细胞中GPS2等的表达水平;在HCC细胞中进行转染,分别使用GPS2的表达载体、GPS2基因的shRNA慢病毒载体在HCC细胞中对GPS2进行过表达或者敲低;同时采用克隆形成实验、划痕实验以及Transwell实验等检测GPS2对HCC细胞增殖、迁移与侵袭的影响。结果在HCC细胞中,过表达GPS2能够抑制HCC细胞系MHCC-97H的增殖、迁移与侵袭,而敲低GPS2能够上调其增殖、迁移与侵袭(P<0.05)。进一步,在MHCC-97H细胞中过表达GPS2能够抑制EGFR、MMP1、MMP3以及MMP9等细胞增殖、迁移与侵袭相关因子的表达水平,而敲低GPS2的表达则能够上调这些因子的表达水平(P<0.05)。结论GPS2是新型HCC调控因子,能够抑制HCC细胞系的增殖、迁移与侵袭。

不同跟踪方式下GPS L2C信号质量评估精度分析

卫星信号质量好坏会影响用户的使用性能,利用软件接收机的跟踪结果可以实现信号质量评估.GPS L2C信号的伪码是由CM码和CL码时分复用(time division multiplexing,TDM)组成,根据其信号特点可以使用不同的跟踪方式进行跟踪.针对不同跟踪方法对信号评估精度的影响,重点分析了信号一致性,信号的相关性能等指标.通过仿真信号分析和实测数据验证,结果表明:联合跟踪相比于单分量跟踪其评估精度更高,且各项指标的评估结果都优于单条支路的评估结果,使用联合跟踪会带来更小的测距误差.

GPS2降低表皮生长因子受体稳定性抑制胃癌恶性进展

目的:研究G蛋白通路抑制因子2(G-protein pathway suppressor 2,GPS2)在胃癌发生发展中的作用及其机制。方法:通过Western blot实验、qPCR实验和免疫组化实验研究GPS2表达及与预后的相关性;MTT法检测过表达GPS2对胃癌细胞活力的影响;Transwell侵袭实验、划痕愈合实验检测GPS2对胃癌细胞侵袭、迁移的影响;Western blot实验、qPCR实验检测GPS2对侵袭、迁移上游EGFR信号通路蛋白表达及活化的影响;蛋白周转、泛素化实验和免疫共沉淀实验研究GPS2对EGFR蛋白稳定性的影响。结果:GPS2在胃癌中低表达且与预后不良相关;GPS2抑制胃癌细胞增殖和侵袭;GPS2下调EGFR蛋白表达水平并抑制其下游与细胞增殖及侵袭迁移相关的信号通路;GPS2通过溶酶体途径降低EGFR的蛋白稳定性;GPS2促进c-Cbl与磷酸化EGFR的结合并进一步促进其泛素化。结论:GPS2通过降低EGFR的蛋白稳定性而抑制胃癌细胞的生长和侵袭并诱导胃癌细胞自噬。

GPS L2C CL码折叠联合快速捕获算法研究

GPS L2C信号是GPS L2频点增加的新型民用信号,与传统导航信号L1C/A码相比,GPS L2C信号的导航电文和伪码结构均作出了改进,伪码由数据和导频双通道组成,数据通道伪码周期20 ms,导频通道伪码周期1.5 s,伪码周期分别是C/A码的20倍和1500倍,较长的伪码有更好相关性以及抗干扰能力,但是长码捕获需要更长的捕获时间。对此,提出一种基于折叠技术联合CM码相位辅助实现CL码的快速捕获方法。在高信噪比和高采样率的工作环境下,通过实测数据分析验证,在伪码折叠次数为5次时,本文方法比时域并行的短码辅助长码捕获方法速度提升了77%,与利用XFAST直捕CL码相比速度提升了93%。

稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc-145细胞系的构建

尽管在全球范围内努力控制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的感染,但该病毒持续在全世界的养猪业中引起经济问题。本研究以PRRSV全长感染性克隆pJXwn06为模板,利用PCR方法扩增ORF2基因序列,并克隆至慢病毒载体中,获得重组质粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。通过慢病毒包装系统获得重组的慢病毒颗粒,并将其转导至Marc-145细胞,用含有嘌呤霉素的培养基进行筛选,初筛后的细胞采用有限稀释法进行克隆,最终获得细胞系,并通过PCR、Western blot试验验证了细胞系中GP2蛋白的稳定表达。本实验成功建立了稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc-145细胞系,为研究GP2蛋白免疫学特性和结构功能奠定了基础。

不稳定块体危岩主动防护网结构计算受力分析与研究

鉴于目前主动防护网设计存在的弊端,根据GPS2型主动防护网结构组成及受力原理,计算不同条件下不稳定块体危岩的下滑力,通过对不稳定块体滑动下滑力、防护网、锚固体受力分析,得出锚固体系为防护治理成败的关键及不同岩体条件下锚固体破坏形式,提出设计中的关键点。

TLR4在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中的作用探讨

目的:探讨TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:利用荧光定量PCR(Real-timePCR)检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ诱导THP-1细胞TFmRNA表达,采用试剂盒检测细胞TF活性;利用自制的β2GPⅠ胶联亲和层析柱(β2GPⅠ-Affi-Gel)分析β2GPⅠ与THP-1细胞表面相应受体结合情况;Real-timePCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导细胞表达TLR4、MyD88、MD-2情况;观察TLR4途径抑制物——紫杉醇是否干预anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的作用。结果:Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞TF表达显著增加(P<0.05);THP-1细胞表面的TLR4能够结合于β2GPⅠ-Affi-Gel柱;Anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)刺激THP-1细胞表达TLR4、MyD88、MD-2显著升高(P<0.05);紫杉醇(1μmol/L)能够抑制anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应。结论:TLR4及相关信号分子在anti-β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF中具有重要作用。

四川省汶川县城区某斜坡危岩体破坏模式及治理

危岩体是西南地区威胁交通和居民区安全的重要隐患。特别是"5.12"地震造成了原危岩体的崩塌,同时又形成了大量新的危岩体。汶川县城区某斜坡危岩体可归纳为三种破坏模式:拉裂—滑移式、整体剪切错落式和弯折—拉裂—倾倒式。危岩体失稳后,落石将会以弹跳、滚动和滑动方式沿坡体下落。运用能量守恒定律和运动学规律来确定落石的动能、落距和弹跳高度,采取GPS2型主动防护网、RX-075型被动防护网及落石槽相结合的措施,确保213国道和居民区的安全。

NF-κB在抗β_2GPⅠ/β_2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达组织因子中的作用探讨

目的:探讨核因子κB(NF-κB)在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导单核细胞株THP-1表达组织因子(TF)中的作用。方法:使用一定剂量的抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物处理THP-1细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞TF mRNA水平,TF活性试剂盒检测TF活性;Western blot检测细胞NF-κB p65、磷酸化-NF-κB p65及NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达情况;进一步采用NF-κB抑制剂(PDTC)观察是否能干预抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对细胞的刺激效应,并利用上游信号分子MAPKs的抑制剂观察抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物对NF-κB p65磷酸化的影响。结果:抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)能够诱导THP-1细胞表达TF mRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05);能够增强细胞内NF-κB p65磷酸化(P<0.05 vs media),降低IκB-α水平(P<0.05 vs media);NF-κB抑制剂PDTC(20μmol/L)能够抑制抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞表达TF及NF-κB磷酸化的效应;MAPKs抑制剂均能影响抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物(100μg/ml)诱导THP-1细胞NF-κB p65磷酸化。结论:在抗β2GPⅠ/β2GPⅠ复合物诱导THP-1细胞表达TF过程中,NF-κB被激活并发挥重要作用,MAPKs为NF-κB的关键上游分子。

Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用

目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。

GPⅢа PLA2、PEAR1、PTGS1基因多态性与阿司匹林临床抗血栓疗效关联性研究

目的:探讨GPⅢаPLA2、PEAR1、PTGS1基因多态性与阿司匹林临床抗血栓疗效的相关性。方法:回顾性筛选我院2015年1月–2016年5月诊断为缺血性疾病并行阿司匹林相关基因检测及血小板聚集率实验室检测的患者信息,共计138例,以花生四烯酸诱导的血小板聚集率数值判断患者服用阿司匹林的疗效,分析影响阿司匹林疗效相关基因多态性。结果:GPⅢаPLA2及PTGS1突变频率较低,PEAR1基因突变频率较高,等位基因频率为63.8%,且突变杂合型频率高于突变纯合型。PEAR1突变纯合型的血小板聚集率显著高于野生型(P=0.007),而突变杂合型与野生型相比未表现出显著性差异(P=0.135)。PEAR1基因突变型(AG和AA)的血小板聚集率显著高于野生型GG(P=0.040),从总体来看,突变位点数目越多,对应的血小板聚集率就越高。结论:PEAR1基因多态性与阿司匹林抗血栓疗效存在相关性,并随着PEAR1的突变基因位点数量增加血小板聚集率也逐渐增加。

β_2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)单克隆抗体(MAbs),并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的人血浆β2GPⅠ免疫BALB/c小鼠,采用PEG融合技术,间接ELISA法和有限稀释法,制备和筛选杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继续扩大培养后注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs。秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目,ELISA测定滴度,Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类,Western blot鉴定特异性。结果:获得1株稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株β2,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108。进一步研究发现,其培养液和腹水滴度为1∶29和1∶215,其MAbs分类为IgG1/κ,Western blot显示纯化的MAbs及标准anti-β2GPⅠ与β2GPⅠ均有反应条带,具有较好的特异性。结论:成功获得并纯化β2GPⅠ单克隆抗体,为进一步研究β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ复合物在抗磷脂综合征中的作用奠定了基础。

oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物调节A7r5表型转化及脂质转运分子表达

目的探讨氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物(oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab complex)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞株(A7r5)表型转化和细胞表面脂质转运分子的影响,以及toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路在其中的作用。方法分别用oxLDL、oxLDL/β2GPⅠ复合物、oxLDL/抗β2GPⅠ抗体复合物、β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物、oxLDL/β2GPⅠ/抗β2GPⅠ抗体复合物刺激A7r5,收集总RNA和蛋白质,利用实时定量PCR、western blot及免疫荧光染色等方法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、巨噬细胞表面标志CD68、半乳糖凝集素3(galectin-3,LGALS3)、B类清道夫受体3(CD36)和ATP结合盒转运体(ATP-binding cassette transporter)A1/G1(ABCA1/ABCG1)的表达情况;用TLR4阻断剂TAK-242(5μmol/L)或c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinases 1/2,JNK 1/2)阻断剂SP600125(90 nmol/L)预处理的方式,观察TLR4及下游信号分子在oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物诱导A7r5表型转化和脂质转运分子表达变化的作用。结果 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物明显上调细胞CD68和LGALS3水平,降低α-SMA表达,而TAK-242能够反转该现象;oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物能够促进细胞表达CD36,同时抑制ABCA1/ABCG1表达,TAK-242和SP600125能够逆转该过程。结论 oxLDL/β2GPⅠ/β2GPⅠ-Ab复合物促进A7r5细胞向"巨噬样"细胞发生表型转变,调节脂质转运相关分子的表达,增强脂质向细胞内转运的能力;TLR4和JNK1/2与该过程密切相关。

惯性约束核聚变实验中子飞行时间谱仪的时间测量插件

大型的惯性约束核聚变(ICF)设施都采用中子飞行时间(nTOF)探测系统测量离子温度。大阵列中子探测器系统作为国际上使用的最主要探测手段,已成为ICF诊断平均密度半径积?ρR?的标准技术。用于“神光III”原型及主机的灵敏中子探测器阵列的时间分辨期望达到1 ns,为此探测器后的电子学系统的时间分辨期望达到100 ps。采用ACAM公司的GP2作为时间测量插件的核心芯片,我们研制了基于VME总线的多通道TDC时间测量插件,其时间分辨小于61 ps。

BD-2/GPS组合系统的设计与定位算法

目前世界上4大主力卫星导航定位系统的兼容技术日益提高和完善,在这种客观需求下使多系统联合定位成为可能。为达到两种系统组合定位的目的,将中国北斗二号(BD-2)与GPS技术相融合,在BD-2单系统定位原理的基础上提出了BD-2/GPS构成的组合接收系统的设计思路和BD-2/GPS组合导航定位系统的数学解算方法。在定位算法上采用了加权最小二乘法对组合导航定位系统进行解算,并通过MATLAB软件对数据结果进行计算和分析,证明了此种算法的可行性和可靠性。

LOH12CR1互作蛋白GPS2的筛选及鉴定

12号染色体短臂杂合子缺失的现象存在于多种血液科肿瘤和实体瘤患者中,提示此区域中可能存在抑瘤基因,LOH12CR1是此区域中已鉴定的基因之一。为探讨LOH12CR1的生物学功能,首先采取酵母双杂交系统筛查其互作蛋白,鉴定到转录调控因子GPS2是其互作蛋白。进一步在HEK293细胞中运用免疫共沉淀方法证实GPS2与LOH12CR1在体内存在相互作用;免疫荧光共定位结果显示GPS2与LOH12CR1在细胞核内存在共定位信号。

抗HLA-I/II抗体、抗心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体与不孕和流产的关系

目的探讨抗HLA-I/II抗体、抗心磷脂抗体(ACA)和抗β2糖蛋白1(β2GP1)抗体与不孕和流产的关系。方法选取2011～2012年在本院就诊的不孕症患者550例、复发性流产患者1650例和正常分娩者150例。对各组分别进行抗HLA-I/II抗体、抗心磷脂抗体和抗β2GP1抗体检测,并将阳性率进行比较。结果不孕组抗HLA-I/II阴性率、ACA和抗β2GP1阳性率分别为76.0%、19.3%和17.5%;RSA组抗HLA-I/II阴性率、ACA和抗β2GP1阳性率分别为85.0%、23.5%和22.7%;均显著高于对照组,P<0.05。结论抗HLA-I/II抗体、抗心磷脂抗体和抗β2GP1抗体是引起不孕和复发性流产的重要因素。