广西壮族自治区1株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因的遗传变异分析

[目的]了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分子流行病学特征并揭示其遗传变异情况。[方法]利用PRRSV实时荧光RT-PCR试剂盒(通用型)对采集自广西壮族自治区某猪场临床发病猪只的肺脏组织样本进行PRRSV检测;利用PRRSV美洲型经典株与类NADC30 PRRSV毒株双重实时荧光RT-PCR试剂盒对样本进行进一步鉴定;采用PCR法扩增GP5基因,将测序获得的核苷酸序列与GenBank数据库中下载的国内外PRRSV参考株GP5基因核苷酸序列进行同源性比对,并构建系统遗传进化树;对GP5基因推导的氨基酸序列进行比对分析。[结果]经鉴定,该份样本呈类NADC30 PRRSV阳性,命名为GXYL株;GP5基因核苷酸序列同源性分析显示,GXYL株与国内外PRRSV参考株同源性为61.9%~93.2%,与美国NADC30毒株的同源性最高,与欧洲型LV毒株的同源性最低;遗传进化树分析显示,GXYL株与美国NADC30毒株以及中国类NADC30毒株位于同一分支,亲缘关系较近,与其他美洲型毒株同处一个大的分支;GP5基因推导的氨基酸比对分析显示,GXYL株共有7个位点发生变异,其中,2个突变位点位于A表位处,1个突变位点位于B表位处,4个突变位点位于信号肽区域,未发现有氨基酸的插入及缺失。[结论]GXYL株为类NADC30 PRRSV毒株,提示该地区应加强对PRRSV流行及变异情况的监控。

猪IL-15与PRRS病毒GP5基因核酸疫苗免疫效力

通过分子克隆技术构建了表达猪白细胞介素(IL)-15及猪繁殖呼吸综合症(PRRSV)病毒GP5基因重组核酸疫苗。以小鼠为试验模型,利用猪IL-15作为分子佐剂并检测其对表达PRRS病毒GP5基因核酸疫苗的免疫增强作用。结果表明,猪IL-15与GP5试验组小鼠抗体水平和T淋巴细胞亚群数量均高于PBS对照组及GP5基因单独免疫组,表明猪IL-15对核酸疫苗可有效增强PRRS病毒GP5基因的免疫效果,证实了其佐剂效应。

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪γ-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定

利用PCR方法分别扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因(编码E蛋白),EMCV的核糖体介入位点序列(IRES)及猪γ-干扰素基因全长序列(IFN-γ),序列测定正确后用DNA重组法将三者串联后插入pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP穿梭质粒中,形成的穿梭质粒plRES-GP5-IFN-γ用PmeI线性化后,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化感受态大肠埃希氏菌BJ5183,经同源重组,构建成含有GP5基因和IFN-γ基因的重组腺病毒载体,pacI酶切线性化充分暴露反向末端重复序列后,脂质体转染HEK293A细胞,借助GFP的表达可以在转染后的2～3天观察到包装病毒rAdeno-GP5-IFN-γ产生,7～10天出现病毒蚀斑。经PCR法及酶切证实各中间过程载体及最终的包装病毒中携带有目的基因,Western-blot证实两基因在腺病毒中得到了表达。大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的基因的腺病毒载体rAdeno-GP5-IFN-γ,重组子能够在HEK293细胞中稳定扩增,病毒包装的成功为进一步研究PRRSVE蛋白的免疫效果及IFN-γ的作用奠定了基础。

密码子优化的PRRSV GP5基因DNA疫苗在鼠体内免疫效力的评价

为了提高表达含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因DNA疫苗的死疫效应,本研究通过人工合成的方法将GP5基因的密码子改造为猪体嗜好的密码子,并将其作为免疫原基因,连同野生型GP5基因,分别插入表达载体pIRES1neo中,构建重组质粒pIR-optiGP5和pIR-GP5.将这两种质粒分别转染293T细胞,转染后48 h,采用间接免疫荧光和Western blot方法检测GP5基因的体外表达情况,结果两种检测方法显示重组质粒pIR-optiGP5的蛋白表达量明显多于pIR-GP5。为了评价DNA免疫质粒pIR-optiGP5的免疫效果,选取30只6～8周龄雌性BALB/c小鼠,将pIRES1neo、pIR-GP5、pIR-optiGP5分别以100μg/只剂量,进行肌肉多点注射,共免疫3次,每次间隔2周,同时,利用间接免疫荧光技术、流式细胞技术、淋巴细胞特异性增殖试验等方法检测其体液免疫和细胞免疫水平。结果显示:DNA免疫质粒pIR-optiGP5在二免后即可检测到荧光抗体,而pIR-GP5在三免后才能检测到;且发现用pIR-optiGP5质粒免疫小鼠,其CD4^+、CD8^+ T淋巴细胞百分数及特异性刺激指数均高于pIR-GP5免疫小鼠,推测经过密码子优化的GP5基因其蛋白在小鼠体内得到了较高水平的表达,并诱导了较强的免疫应答,这为进一步研究和设计有效的PRRSV DNA疫苗提供了新的思路。

PRRSVJL/07/SW毒株GP5基因克隆与原核表达

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株核苷酸序列,设计了扩增PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因的1对引物,利用RT-PCR方法,从PRRSV JL/07/SW毒株的细胞培养物中成功的扩增出GP5基因,其中GP5基因全长603 bp,与国际PRRSV美洲型VR-2332毒株的GP5基因序列同源率为89.2%;随后,将该基因与原核表达载体pGEX-4T-1连接,转化到宿主菌BL21中进行表达。结果证实PRRSV JL/07/SW毒株GP5基因成功地进行了原核表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白含量的22.8%。

山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株GP5基因遗传变异分析

为了解山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子特征,收集临床发病猪群肺脏样品31份,应用RT-PCR方法检测其遗传变异情况。结果表明,25份肺脏样品检测呈阳性(阳性率80.6%),分离获得16个毒株。通过对分离株GP5基因序列进行分析,表明16株PRRSV均为美洲型,分布于4个基因亚型,其中7株PRRSV与高致病性PRRSV处于同一分枝,同源性介于78.2%~99.2%,6株PRRSV与NADC30毒株处于同一分枝,同源性介于85.0%~95.8%间。因此,山东省PRRSV流行毒株呈现基因多样化,在该病防控中应加强新变异株监测,加强猪场生物安全措施与病毒净化。

PRRSV GZJL株GP5基因的克隆及原核表达

为成功表达PRRSV GZJL株GP5蛋白,本研究设计合成一对引物,并以PCR方法从阳性重组质粒pMD18-T-GP5中扩增得到PRRSV GZJL株GP5基因片段中的79-600 bp即dGP5。将dGP5基因连接至原核表达载体pET-32a（＋）,并转化入表达菌株BL21（DE3）。经PCR、双酶切和测序鉴定,阳性菌株进行IPTG诱导表达,纯化的融合蛋白His-dGP5应用SDS-PAGE和Western-blotting方法进行分析,结果表明,本研究成功构建了原核表达菌株,其所表达的融合蛋白His-dGP5的分子量约为40.2 kDa且可被PRRSV阳性血清所识别。这为进一步研究PRRSV新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增PRRSV Hn/06-1分离株GP5基因片段.将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,测序后用DNAstar序列分析.构建的pcDNA-GP5重组质粒瞬时转染293T细胞,48 h后用Western-blot检测,证明GP5基因在293T细胞中获得了表达,可与PRRSV阳性血清发生特异性反应.

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建

采用RT PCR技术从长白猪的肌肉组织中扩增出了泛素 (Ubiquitin)基因 ,并将其克隆到 pGEM Teasy载体 ,经测序表明 ,所克隆的基因与GenBank中已登录的序列同源性达 99%。利用设计的融合表达引物 ,分别将泛素基因与猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV )GP5蛋白成熟肽基因进行扩增 ,用重叠区扩增基因拼接法将 2个基因片段进行拼接 ,并插入真核表达载体 pcDNA4 .0HISMAXA中 ,构建出了 pcDNA U GP5重组质粒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒乌鲁木齐分离株GP5基因遗传变异分析

为对乌鲁木齐市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传变异情况进行研究与分析,应用RT-PCR方法对疑似感染PRRSV猪的组织脏器进行PRRSV GP5基因的扩增,将阳性样品PCR产物进行克隆和测序,并应用分子生物学软件对测序结果进行比对和遗传进化分析。结果显示,5株病毒分离株GP5基因全长均为603 bp,与JXA1株亲缘关系较近,同属于美洲株的同一基因亚群。本试验结果为掌握乌鲁木齐市PRRSV的分子遗传变异情况提供了依据。

陕西及周边地区PRRSV Nsp2与GP5基因变异分析

【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp2和GP5的变异情况。【方法】采用套式RT-PCR方法,从肝、脾、肺和血清中直接扩增Nsp2、GP5基因并克隆测序,将获得的PRRSV流行毒株序列与GenBank中30个PRRSV参考毒株进行比对分析,构建进化树。【结果】获得了13株PRRSV的Nsp2基因序列（GenBank登录号KM233849~KM233861）和12株GP5基因序列（GenBank登录号KM233862~KM233873）。基因进化树分析显示所有测定PRRSV流行毒株均属北美洲型。对Nsp2基因序列分析发现,12株PRRSV为氨基酸缺失毒株,1株PRRSV为经典毒株。发现GSXF毒株有可能是一株重组毒株。PRRSV变异株与经典株相比,GP5蛋白中存在多处氨基酸点突变。【结论】陕西猪场PRRSV流行毒株以变异株为主,同时存在经典毒株和重组毒株。

PRRS吉林株GP5基因序列测定与分析

PRRSV易引起基因变异现象,使得异地疫苗不能有效地控制本地区PRRS的发生。为研制适合本地区的亚单位疫苗,试验参照GeneBank中已发表的PRRSV序列设计了1对特异性引物,对吉林分离株JL-0605对GP5基因进行了序列扩增和测序,序列分析结果表明,PRRSV JL-0605株GP5氨基酸序列与CH-1α和HEB1株氨基酸序列高度一致,而与VR-2332和BJ-4株有一定的差异,和LV株在N端及中心区具有很大的差异,JL-0605株GP5蛋白抗原性及亲水性与中国河北株具有较高的相似性;与VR-2332株相比,30～40位氨基酸处抗原表位形态发生较大变化,在135～145位氨基酸处抗原表位优势增强现象。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆和原核表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)可引起各种年龄猪的呼吸系统和母猪繁殖机能障碍,导致猪场损失严重,其中GP5蛋白在PRRSV病毒侵入、致病及免疫保护中发挥重要作用。提取猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA,反转录合成cDNA,PCR扩增获得GP5基因,片段大小为600bp。将GP5基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定,重组质粒PGEX-6P-1-GP5构建成功,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,Western blot分析重组蛋白的反应原性。结果表明,重组融合蛋白His-GP5分子质量约为41ku,主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的35%以上,纯化后的重组蛋白占总蛋白的75%以上;并且该重组蛋白能与猪的阳性血清反应,说明其具有较好的免疫原性。研究结果为基因工程疫苗的研发和GP5的抗体制备奠定了基础。

猪C3d分子佐剂PRRSV GP5基因核酸疫苗的构建及免疫效果的研究

【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n(2、4、6)串联体,然后分别将P28.n(2、4、6)连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n(2、4、6)重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n(2、4、6)中,构建了PRRSV GP5重组质粒(pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6);通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著(P<0.05)。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达

本研究从河北省保定地区6份疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)病猪的肺脏中,通过RT-PCR获得PRRSV GP5蛋白完整的基因片段,克隆至pMD18-T载体。经测序鉴定正确后,再设计一对引物从重组载体pMD18-T-GP5中扩增出缺失了N端30个氨基酸残基的dGP5的编码序列dORF5,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建原核重组质粒(pGEX-6p-dGP5),转化至E.coli BL21感受态细胞。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳可检测到分子质量为40ku的目的蛋白。经Western blot分析表明,该蛋白与PRRS阳性血清具有良好的免疫反应性,为进一步研究PRRS新型基因工程疫苗和诊断试剂奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒部分Nsp2基因及GP5基因的克隆与序列分析

为掌握目前长春及周边地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行动态及遗传变异规律,选取PRRSV CC-13株的部分Nsp2和GP5蛋白基因为研究对象,通过RT-PCR方法扩增获得这些基因片段,对其进行克隆、测序,再用MEGA(4.0)等生物软件分别对其核苷酸及其推导氨基酸序列与从GenBank中选取的10余株代表毒株的相应序列进行比较。这不仅为CC-13分离毒株的遗传变异特性及来源提供了解,同时也为本地区PRRS的防制及进一步研究本地区PRRSV的分子生物学特性提供数据依据。

绵羊GP5基因的生物信息学分析

为探讨绵羊血小板糖蛋白V基因(Glycoprotein V,Platelet,GP5)编码蛋白的结构和功能,以NCBI网站的GenBank数据库中发布的绵羊GP5基因序列(登录号为XM_027965957.1)为基础,采用生物信息学在线工具和软件对绵羊的GP5基因进行生物信息学分析。结果表明,绵羊GP5基因序列中包含1个最大长度为1620 bp的开放阅读框,推测其编码539个氨基酸,其中亮氨酸含量最多,为22.6%。GP5基因所编码的蛋白其相对分子质量约为59305.38 KDa,理论等电点为9.40;亚细胞定位结果表明其主要位于内质网(44.4%)。GP5蛋白含有信号肽和跨膜螺旋结构,在二级结构预测中,该蛋白以无规卷曲为主,为70.14%。GP5蛋白三级结构主要由无规卷曲折叠缠绕形成,与二级结构预测结构一致。

2014—2016年广东省PRRSV GP5基因遗传变异分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异情况,采集了2014—2016年间广东地区46个猪场317份疑患PRRS的临床样品进行检测,并对阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,选出21株PRRSV GP5基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明：所分离的PRRSV均属于美洲株,21株PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.4%-98.7%和78.6%-98.5%,其中2株与美国NADC30分离株同属亚群Ⅲ,10株与近几年广东省内分离的PRRSV毒株QYYZ和GM2同属于亚群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遗传进化分析结果表明,亚群Ⅲ和亚群Ⅳ是近几年在广东省内流行的新兴亚群,研究结果将为PRRSV疫苗的选择以及防控方案的制定提供参考。

来源于巴马香猪的高致病性PRRSV分离株GP5基因测序与分析

为了解河池市巴马香猪规模场内的主要疫病流行病学情况,通过RT-PCR方法,从发病猪群采集了34份组织样品中检测出1份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性,经基因扩增、序列测定、比对等试验得到GP5基因,阅读框为603bp,编码201个氨基酸,进行核苷酸、氨基酸同源性比对分析。结果表明,分离株与2015年广西施开创分离到的毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为98.7%和97.5%,亲源性最近。