PRRSV JL/07/SW毒株GP5重组蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究将以纯化的重组GP5蛋白作为包被抗原,建立了诊断PRRS的间接ELISA方法。实验确定了最佳抗原包被浓度为2.30μ/mL,PRRSV阳性血清稀释度为1∶100。用间接ELISA方法检测猪瘟、猪细小病毒、猪戊肝病毒阳性血清无交叉反应,证明有很好的特异性。

串联表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5表位蛋白间接ELISA方法的建立

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5抗原表位串联表达重组蛋白作为包被抗原,建立检测PPRSV抗体的间接ELISA方法。重组蛋白最佳包被浓度为7.5μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,37℃封闭2h;血清最适稀释度为1∶100,37℃作用2h;兔抗猪IgG/辣根酶(HRP)(1∶3000),37℃作用2h;37℃避光显色15min读取D450nm值。结果经统计学分析得出,S/P值≥0.254为阳性,S/P值≤0.212为阴性。所建立的ELISA方法检测其他5种猪常见病原阳性血清,其D450nm值均小于0.212。利用建立的ELISA方法对临床免疫勃林格殷格翰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗4周后的猪血清70份进行检测,其D450nm值均大于0.85,表明本研究建立的重组GP5表位蛋白间接ELISA方法可用于临床样品的监测。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白的真核表达及免疫原性评价

为了解我国猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行及进化情况并开发针对流行谱系的亚单位疫苗,对2001-2021年间分离于我国的PRRSV毒株进行遗传进化分析,选用优势流行谱系代表毒株,优化其GP5和M蛋白的基因序列,与干扰素(interferon,IFN)和免疫球蛋白的Fc区串联后,构建真核表达质粒pCDNA3.4-IFNα-GP5-Fc和pCDNA3.4-IFNα-M-Fc,并使用HEK293T真核表达系统表达重组蛋白IFNα-GP5-Fc和IFNα-M-Fc。将2种重组蛋白与ISA206VG佐剂混匀,免疫断奶仔猪,通过酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbentassay,ELISA)及中和试验评价体液免疫水平,酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评价细胞免疫水平。试验结果表明,NADC30-like谱系为近年我国主要流行的谱系,IFNα-GP5-Fc和IFNα-M-Fc组合免疫仔猪能诱导高水平的抗体和细胞免疫,该研究为制备更为安全有效的新型PRRSV亚单位疫苗奠定基础。