表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株,以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体,以gI/gE基因为插入靶点,利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因,并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒,经噬斑纯化,成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明,该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性,易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索,同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为 6 0kD的融合蛋白GST GP5 M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P5 6 ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX ELISA总符合率为 94 1% ,表明建立的P5 6 ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P5 6 ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD6 30nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。