微小隐孢子虫糖蛋白GP900对HCT-8细胞Akt和MAPK通路的影响

目的探讨微小隐孢子虫糖蛋白GP900对HCT-8细胞Akt和MAPK信号通路的影响,为进一步研究微小隐孢子虫与宿主细胞的相互作用提供理论依据。方法以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,PCR扩增GP900基因片段,回收后连接到pMD-18T载体,构建重组克隆质粒pMD-18T-GP900。双酶切pMD-18T-GP900和pET-32a载体并进行连接,构建pET-32a-GP900重组质粒,双酶切及测序鉴定正确后转化入大肠埃希菌BL21(DE3),重组菌用IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析GP900的表达。采用Ni-NTA亲和层析富集和超滤纯化GP900重组蛋白用Triton-114去除内毒素,直至重组蛋白内毒素含量在0.01~0.1Eu/mg为止,然后用Hydrophobic beads吸附残留的Triton-114,收集重组蛋白。用GP900重组蛋白刺激HCT-8细胞,收集不同刺激时间的细胞,提取全蛋白,采用Western blot检测Akt、p38和ERK的磷酸化;用不同浓度GP900刺激后检测细胞中上述通路蛋白的磷酸化与GP900剂量的关系。结果 pET-32a-GP900重组质粒经双酶切及测序鉴定构建正确,表达的重组GP900蛋白分子质量与理论值相符。纯化的重组蛋白刺激HCT-8细胞后,Akt在60min发生磷酸化且随着GP900浓度增加磷酸化程度呈剂量依赖,p38在60min发生磷酸化但不呈剂量依赖,ERK在90min发生磷酸化但不呈剂量依赖。结论成功构建了GP900重组质粒,表达的GP900重组蛋白可诱导HCT-8细胞Akt、p38和ERK信号通路活化。