外源人gp96基因在肿瘤细胞中的高效表达

背景与目的:从肿瘤细胞中分离出的热休克蛋白gp96制备物免疫小鼠可产生抗相应肿瘤的特异性保护性细胞毒性T细胞免疫应答,为肿瘤免疫治疗开辟了一条新的可行性途径。但通常gp96在细胞中的表达水平较低,从有限的细胞或组织中获得的gp96制备物难以满足研究的需要。因此,本研究拟为制备高质量和充足的gp96而建立高表达gp96的单克隆细胞株。方法:构建人gp96cDNA的重组表达质粒pcDNA-hgp96并将其转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的阳性细胞克隆,然后用Western印迹分析单克隆细胞株的gp96表达量。结果:成功构建了人gp96的重组表达质粒,建立了稳定转染的单克隆细胞株,并筛选出一株高表达gp96的单克隆细胞。结论:成功建立了高表达gp96的单克隆细胞株,为gp96抗肿瘤免疫的研究奠定了基础。

热休克蛋白gp96表达对B16F10细胞生长的影响

目的 探讨热休克蛋白gp96表达对B16F10细胞株生物学行为的影响。 方法 构建gp96正义和反义真核重组表达质粒 pcDNA hgp96和 pcDNA anti96P ,并转染B16F10细胞 ,G 418筛选稳定转染的阳性细胞克隆 ,然后Western印迹分析细胞gp96的表达情况 ,绘制细胞生长曲线 ,观察 gp96表达对细胞生长特性的影响。 结果 转染了 gp96正义表达质粒的B16F10细胞gp96表达水平升高 ,细胞生长缓慢 ,倍增时间延迟 ;反义gp96表达质粒明显抑制了B16F10细胞 gp96表达 ,使细胞倍增时间提前。结论 热休克蛋白 gp96表达水平升高可抑制肿瘤细胞的生长 ,而 gp96表达水平下降则肿瘤细胞生长速度加快 。

gp96-肽复合物体外对脾淋巴细胞基因表达及其抗肿瘤效应研究

目的:研究H22肿瘤细胞来源的gp96-多肽复合物体外对小鼠脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA表达的影响;并观察其培养上清诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学变化。方法:利用蛋白提取纯化技术提取H22肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96,Western blotting法鉴定所得目的蛋白;RT-PCR法检测细胞TNF-α和IFN-γmRNA的表达水平;激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜观察细胞培养上清诱导H22肿瘤细胞的形态学变化。结果:经鉴定获得纯化的热休克蛋白gp96;gp96肽复合物诱导组的脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA的表达强度(RV)分别为0.20±0.02及0.22±0.01,明显高于对照组的0.11±0.02、0.11±0.01和0.10±0.01、0.11±0.01(P<0.05);实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论:H22肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能在体外增强小鼠脾淋巴细胞TNF-α、IFN-γmRNA的表达;同时,经诱导的脾细胞能分泌免疫活性物质诱导H22细胞凋亡。

小鼠热休克蛋白GP96基因真核表达载体的构建及其表达

目的构建小鼠热休克蛋白GP96（GP96）基因真核表达载体并在真核细胞293T中表达。方法用RT—PCR法从小鼠脾脏扩增出GP96的成熟肽基因片段，先克隆于pMD19-T载体，再亚克隆到真核表达载体peDNA3．1中。以脂质体法将重组质粒转入293T细胞，免疫印迹法鉴定GP96的蛋白表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明，扩增出GP96基因完全正确；免疫印迹法检测表明，转染的重组质粒能在293T细胞中高效表达。结论构建的pcDNA3．1-GP96重组载体在293T细胞系中高效表达，为深入研究GP96作为DNA疫苗在病毒性心肌炎中的作用及机制打下基础。