热休克蛋白gp96-肽复合物的提取及纯化

目的:建立从H22肝癌细胞中提取、纯化热休克蛋白gp96肽复合物的方法。方法:①制备H22肝癌细胞蛋白:将H22肝癌细胞裂解、离心、过滤及透析后获得。②gp96肽复合物的纯化:上述可溶性H22肝癌细胞蛋白经分级硫酸铵盐析后,依次用ConASepharose亲和层析、SephadexG25更换缓冲液及DEAESephacel离子交换层析分离纯化。③gp96肽复合物的鉴定和浓度测定:所得蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot进行蛋白分子量及性质鉴定,Lowry法测定蛋白浓度。结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染鉴定为单一带,分子量为96kD;Westernblot结果证实为HSPgp96。每20ml压积H22细胞最终获得1mg的HSPgp96。结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度HSPgp96肽复合物。

gp96-肽复合物体外诱导CTL反应及其抗肿瘤效应研究

目的研究小鼠肝癌腹水瘤H22细胞来源的gp96-肽复合物体外诱导小鼠脾淋巴细胞特异性细胞毒T细胞(CTL)的产生及其抗肿瘤效应。方法利用蛋白提取纯化技术、Western blot法、细胞培养技术、流式细胞术、CCK-8法、RT-PCR法等研究gp96-肽复合物体外诱导扩增CTL及其抗肿瘤效应。结果流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8^+T细胞比例达到近70％,远远高于对照组的35％、26％。该活化的CTL细胞在效靶比为50：1时的肿瘤细胞杀伤率达72％与对照组相比具有统计学意义；将活化的CTL细胞回输小鼠体内能产生对该肿瘤细胞良好的过继性免疫保护,延长荷瘤小鼠的生存时间；RT-PCR法检测该活化的脾细胞较正常脾淋巴细胞高表达IFN-γ mRNA。结论小鼠肝癌腹水瘤H22细胞来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,并增强脾细胞IFN-γ mRNA的表达,该CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫作用。

GP96-肽复合物免疫小鼠脾淋巴细胞CD8^+细胞内的CA^(2+)浓度变化

目的:检测GP96-肽复合物免疫小鼠脾淋巴细胞特定亚群CD8+细胞内的钙离子浓度变化,从而进一步探讨GP96-肽复合物疫苗的免疫效应和机制。方法:以GP96-肽复合物免疫小鼠的脾淋巴细胞作为研究对象, 用QUANTUM-RED标记的抗膜表面抗原CD8+进行膜表面染色的同时,进行FLUO-3/AM负载及细胞内CA2+浓度的检测,以双色流式细胞术检测特定亚群淋巴细胞内的CA2+浓度的变化,钙离子载体A23187、MNCL2和CON A作为小鼠脾淋巴细胞CD8+细胞[CA2+]I的刺激因素。结果:经GP96-肽复合物免疫小鼠脾淋巴细胞CD8+细胞[CA2+]I有一定水平的上调。与对照组相比,A23187和CON A可显著提高GP96-肽复合物免疫小鼠脾淋巴细胞CD8+细胞[CA2+]I 的水平。结论:[CA2+]I浓度的上升可能与GP96-肽复合物促进淋巴细胞CD8+T淋巴细胞的活化及增殖有关。

热休克蛋白gp96-肽复合物肿瘤疫苗的应用前景与挑战

肿瘤组织来源的热休克蛋白gp96-肽复合物(heat shock protein 96-peptide complex,HSPPC-96)结合有肿瘤特异性抗原多肽,能够诱导特异性抗肿瘤免疫。自体HSPPC-96疫苗在延缓肿瘤复发和提高患者总体生存率等方面彰显优势,应用前景广阔。然而作为自体来源的个体化疫苗,HSPPC-96疫苗的实施和推广也面临着巨大的挑战,如肿瘤组织来源限制、对晚期肿瘤疗效不明确等问题。本文综合分析了HSPPC-96疫苗免疫治疗的临床进展、应用前景及其面临的挑战。

gp96-肽复合物体外诱导脾淋巴细胞及其抗肿瘤效应

目的研究H22肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导小鼠脾淋巴细胞的特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的产生及其抗肿瘤效应。方法利用蛋白提取纯化技术、细胞培养技术、流式细胞术、CCK-8法、免疫荧光技术等。结果经鉴定获得纯化的热休克蛋白;流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8T细胞比例达到近70%,远远高于对照组的35%、26%;该活化的CTL细胞在效靶比为50∶1时的肿瘤杀伤率达72%与对照组相比具有统计学意义;激光共聚焦显微镜观察证实实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,该活化的CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫保护作用并能分泌免疫活性物质诱导H22肿瘤细胞凋亡。

人肾癌组织中热休克蛋白gp96-肽复合物提取、纯化及体外的免疫效应

目的建立从人肾癌组织中提取、纯化热休克蛋白(HSP)gp96肽复合物的方法,并检测其体外免疫效应。方法采取三步蛋白纯化法从人肾癌患者肿瘤组织中提取、纯化HSPgp96肽复合物,SDSPAGE、Westernblot鉴定HSPgp96肽复合物。应用酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测HSPgp96肽复合物、单纯多肽产生γ-干扰素效应T细胞频数的体外免疫活性。结果应用该方法提取的蛋白质经SDSPAGE和Westernblot特异性鉴定,证实是HSPgp96肽复合物;蛋白得率为每g湿重肾癌组织可纯化HSPgp96肽复合物40～60μg。γ-干扰素ELISPOT检测,HSPgp96肽复合物组产生γ-干扰素效应T细胞频数最高(287.50±22.34),以后依次为单纯多肽组(135.25±12.80)、阳性对照组组(102.25±14.76)、阴性对照组(35.50±11.10),各组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);HSPgp96肽复合物组与单纯多肽组、阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);单纯多肽组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论三步蛋白纯化法不仅操作简便、重复性高,而且提取的HSPgp96肽复合物具有高获率、高纯度、高特异性及高免疫效应等优点。

热休克蛋白gp96-肽复合物体外对人肝癌细胞的抗肿瘤效应

目的研究热休克蛋白gp96-肽复合物修饰树突状细胞(DC)后对人肝癌细胞的体外特异抗肿瘤效应。方法从人原发性肝癌组织中提取gp96-肽复合物,用其修饰DC细胞后与T淋巴细胞共同培养,以MTT法检测该复合物介导的细胞毒性T细胞(CTL)对不同来源人肝癌细胞的抗肿瘤效应,并与粗提抗原修饰DC细胞组相比较。结果 gp96-肽复合物诱导的CTL对原代肝癌细胞杀伤效率为74.3%,明显高于粗提抗原组(42.5%)和未加抗原组(14.4%)(P<0.01),粗提抗原组对肝癌细胞杀伤效率高于未加抗原组(P<0.01)。且该复合物的抗肿瘤效应具有一定的组织特异性。结论 gp96-肽复合物修饰的DC细胞,在体外能刺激产生特异的抗肿瘤细胞毒性T细胞,因而热休克蛋白gp96在肿瘤免疫治疗中具有重要的实用价值。

肺癌gp96-多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应的实验研究

目的 研究热休克蛋白gp96 多肽复合物负载树突状细胞 (dendriticcell,DC)后 ,能否诱导出gp96 多肽复合物特异性的细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)反应。方法 从一例肺癌患者肿瘤组织中提取gp96 多肽复合物和自体肿瘤细胞溶解物 ,分别负载从该患者骨髓血中培养的DC。以不同形式的抗原 /DC疫苗分别刺激由患者外周血中分离的淋巴细胞。采用ELISA法检测淋巴细胞所释放的IFN γ量作为CTL反应的指标 ;以Cr51 释放实验分析致敏后的淋巴细胞对不同靶细胞的裂解和杀伤作用。结果 所有肿瘤抗原致敏淋巴细胞后均可以诱导产生CTL反应 ,其中以gp96 多肽复合物 /DC疫苗诱导释放的IFN γ量最高。肿瘤抗原致敏淋巴细胞后对原代培养的肿瘤细胞的杀伤作用高于PG细胞和K5 62细胞。结论 自体肿瘤组织中提取的gp96 多肽复合物能诱导出肿瘤特异性CTL反应 ,而负载DC后能激发起更强的CTL。

热休克蛋白gp96肽复合物诱导的抗肿瘤免疫

目的: 用不同种类肿瘤提取的热休克蛋白 (HSP)gp96 肽复合物纯化后免疫动物,观察其诱导抗肿瘤免疫的效应,并初步探讨其机制。方法: 从肿瘤细胞中制备HSPgp96 肽复合物, 观察其免疫诱导作用。用不同剂量及不同来源的gp96 肽复合物免疫 6组小鼠后, 用H22癌细胞攻击, 观察各组小鼠的肿瘤发生率、瘤重及瘤组织的形态学变化并与对照组相比较。观察gp96 肽复合物对小鼠腹腔巨噬细胞分泌一氧化氮 (NO)和杀瘤活性的影响。结果: 获得的纯化HSPgp96 肽复合物的Mr为 96 000。gp96 肽复合物的免疫效果与其剂量有关, 以 18μg/只的效果最明显。交叉免疫实验证明, 免疫小鼠能抵抗同种肿瘤细胞的攻击, 而对异种肿瘤细胞的则无免疫保护作用。gp96 肽复合物可刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO同时杀瘤活性增高。结论: 从肿瘤细胞中分离纯化的HSPgp96 肽复合物免疫小鼠后, 可获得特异性的抗肿瘤作用; 其对肿瘤细胞的杀伤作用与gp96 肽复合物能增强小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO增多有关。

肿瘤源性热休克蛋白gp96诱导淋巴细胞反应及其抗肿瘤效应

目的研究肿瘤细胞来源的热休克蛋白gp96-多肽复合物在体外诱导脾淋巴细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。方法利用蛋白纯化技术、SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot法分离纯化、鉴定gp96-多肽;通过流式细胞术、免疫荧光技术、CCK-8法等检测经gp96多肽诱导的CD8+T细胞及其抗肿瘤效应。结果经鉴定获得纯化的热休克蛋白;流式细胞仪检测表明,经gp96-肽复合物诱导后的CD8+T细胞比例达到近70%,远远高于对照组的35%、26%;该活化的CTL细胞在效靶比为50∶1时的肿瘤杀伤率达72%,与对照组相比具有统计学意义;激光共聚焦显微镜观察证实实验诱导组的培养上清能诱导H22肿瘤细胞凋亡的形态学改变。结论肿瘤来源的热休克蛋白gp96-肽复合物能诱导小鼠脾淋巴细胞的CTL反应,该活化的CTL具有特异性抗H22肿瘤细胞的免疫作用,并能分泌免疫活性物质诱导H22肿瘤细胞凋亡。

96gp负载树突状细胞联合化疗抗耐药卵巢癌的研究

目的探讨96gp负载树突状细胞联合化疗抗耐药卵巢癌的效果。方法使用树突状细胞中的96gp多肽复合物作为抗原来刺激树突细胞从而增加抗原递呈作用,加大对卵巢癌细胞的杀伤力,为临床治疗卵巢恶性肿瘤提供依据。选取一定的人卵巢癌细胞(SKOV3)和耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP),从中提取gp96多肽复合物,对其进行鉴定,然后使用脐血将树突细胞(DC)诱导后进行培养,待细胞成熟后将其和gp96相结合制成gp96-DC复合物,然后分别将一般DC和载有抗原的DC分别与脐血有核细胞、人外周血T淋巴细胞相结合,比较分析两者对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞的杀伤作用效果。结果 gp96为热休克蛋白,它与DC结合后的抗原树突细胞对卵巢癌以及耐药卵巢癌细胞的杀伤作用更大,单纯DC对两种癌细胞杀伤力较弱。结论 gp96-DC在卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞中有很强的杀伤作用,为临床卵巢癌的治疗提供科学依据。

负载gp96多肽复合物的树突状细胞抗耐药卵巢癌细胞株作用的实验研究

目的:探讨以卵巢癌细胞(SKOV3)热休克蛋白gp96多肽复合物作为抗原,刺激树突状细胞增强其抗原呈递功能,增加对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞在体外的杀伤作用,为临床卵巢癌的辅助免疫治疗提供实验依据。方法:从卵巢癌细胞中提纯出gp96多肽复合物,并对其进行鉴定;与脐血诱导培养的树突细胞(DC)结合,制备gp96-DC复合物;将DC和负载抗原的DC分别加入脐血有核细胞和人外周血T淋巴细胞中,研究二者对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞的体外CTL效应。结果:提取后的蛋白质经WesternBlot鉴定,表明该蛋白为热休克蛋白gp96;两种DC对脐血有核细胞和人外周血T淋巴细胞均有明显的活化作用,但gp96-DC对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞有更强的杀伤活性。结论:卵巢癌细胞提取的热休克蛋白gp96刺激的树突状细胞疫苗在体外对卵巢癌细胞和耐药卵巢癌细胞具有明显的杀伤功能,作为一种辅助治疗手段为卵巢癌患者的治疗带来希望。

基础理论

哈萨克族恶性肿瘤患者构成特征分析；重组表皮生长因子受体噬菌体疫苗的抗肿瘤效果；gp96-肽复合物体外诱导脾淋巴纲胞基础及其抗肿瘤效应；白术挥发油抗肿瘤作用的研究；参麦注射液联合羟基喜树碱抑制盘管生成作用的实验；三氰化二砷对鸡胚尿囊膜血管形成的抑制作用。