甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPATs)的研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases,GPATs)催化甘油三酯和甘油磷脂合成的第一步反应。目前在哺乳动物已发现四种亚型GPAT1-4,其中GPAT1和GPAT2定位于线粒体外膜,而GPAT3和GPAT4定位于内质网。GPATs在调节细胞甘油三酯和磷脂含量中起着重要的作用。基因过表达和敲除实验证实GPATs在肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗和肥胖的发生发展过程中起着重要作用,并且部分亚型影响泌乳、精子发生等过程。本文将就GPATs各亚型的功能特点进行综述。

植物GPATs基因研究进展

甘油-3-磷酸酰基转移酶(Glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)生物合成的限速酶,催化TAG生物合成的起始步骤。GPATs主要负责将脂肪酰基从酰基-酰基载体蛋白(acyl-ACP)或酰基辅酶A(acyl-CoA)上转移到甘油-3-磷酸的(Glycerol-3-phosphate,G3P)sn-1位置上。有些成员还具有sn-2酰基转移活性。目前已经在多种植物中克隆得到了GPAT基因。这些GPAT基因编码的酶主要分为三类,它们在细胞中分别定位于质体、线粒体和内质网上。这些酶参与三酰甘油、几丁质和软木脂等多种脂质的生物合成,在植物的生长发育中发挥着非常重要的作用。文章介绍了植物GPAT基因的染色体定位和基因结构以及GPAT酶的亚细胞定位、sn-2酰基转移特异性、GPAT酶的底物选择性及其生理功能的最新研究进展。

蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员鉴定及其在干旱胁迫下的表达模式分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT,glycerol-3-phosphate acyltransferase)是三酰甘油(TAG,triacylglycerol)生物合成的核心酶,在植物生长发育以及抗逆过程中发挥重要作用。本研究基于蒿叶猪毛菜(Salsola abrotanoides L.)转录组数据,利用生物信息学和q RT-PCR方法,对蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员进行鉴定分析并探究其表达模式。以BLASTP比对和HMM搜索2种方法共鉴定出35个GPAT成员;理化性质分析表明,大多数蛋白属于碱性蛋白;亚细胞定位预测表明,Sa_GPAT家族成员主要分布于内质网;空间结构预测显示,二级结构主要以α螺旋为主,三级结构较为稳定。系统发育树分析显示,该家族分为4个亚家族,其中组别4为特有亚家族,且与拟南芥GPAT家族不存在聚类关系。信号肽预测显示蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中未存在信号肽,且跨膜结构分析表明蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中约63%存在跨膜结构。表达模式分析表明,蒿叶猪毛菜GPATs呈现组织特异性表达,其中Sa_GPAT003在幼苗中高度表达,结合幼苗干旱胁迫转录组结果发现多数Sa_GPAT家族成员响应外界干旱胁迫,其中Sa_GPAT032在干旱胁迫后表达量极显著升高。由此推测,蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员可能在抵抗干旱胁迫方面起着重要作用。

江泉黑猪GPAT 3基因多态性及其与生长性状的关联分析

【目的】探究江泉黑猪甘油-3-磷酸酰基转移酶3(glycerol-3-phosphate acyltransferase 3,GPAT3)基因多态性及其与生长性状的相关性,为江泉黑猪的遗传改良和优化繁殖计划提供理论和技术支持。【方法】采集292头江泉黑猪的耳组织样并提取DNA,PCR扩增GPAT 3基因片段,结合Sanger测序与MassARRAY核酸质谱分析系统检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点及基因分型。利用R语言3.6.2、HaploView、PHASE等软件进行GPAT 3基因SNP位点的遗传效应、连锁不平衡和单倍型分析。利用SAS 9.2软件分析GPAT 3基因SNP位点及其构成的单倍型块与江泉黑猪生长性状的相关性。【结果】在GPAT 3基因及其5′-调控区共发现10个SNPs,其中4个为低度多态,6个为中度多态;7个SNPs位点基因型频率分布处于哈代-温伯格平衡状态。关联分析发现,9个SNPs与江泉黑猪生长性状呈显著关联(P<0.05),其中g.134957929 G>A、g.134957930 G>T、g.134958013 G>A和g.134976983 T>C存在极强连锁,构建的AGGT/AGGT双倍型在胸围、体高方面具有显著优势(P<0.05),GTGC/GTGC双倍型和GTGC单倍型在体长方面具有显著优势(P<0.05);g.135002556 C>A、g.135002627 C>T、g.135002680 C>T存在极强连锁,构建的ATC/ATC双倍型在胸围、腹围方面具有显著优势(P<0.05),CCC/ATC双倍型在背膘厚方面具有显著优势(P<0.05),ATT单倍型在腹围方面具有显著优势(P<0.05)。【结论】江泉黑猪GPAT 3基因具有丰富的多态性位点,9个SNPs及其构成的2个单倍型块与江泉黑猪胸围、腹围、体高等有显著关联性,可作为江泉黑猪生长性状选育的分子遗传标记。

半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT3信号通路对甲减模型大鼠脂质代谢异常的保护作用

目的探讨半硫丸调控AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路,改善甲减模型大鼠脂质代谢异常的作用及其机制。方法60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、优甲乐组、半硫丸低剂量组、半硫丸高剂量组、联合用药组,每组10只,除正常组外,其余各组大鼠灌胃给予10 mg/kg丙硫氧嘧啶4周制备甲减模型,造模成功后干预6周,ELISA法检测血清甲状腺功能及血脂水平,RT-qPCR法检测肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达,Western Blot法检测肾周脂肪组织TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血清FT3、FT4降低(P<0.01),TSH、TG、TC、LDL-C水平升高(P<0.01),肾周脂肪组织PPARγ、GPAT_(3)mRNA表达以及TSHR、PPARγ、GPAT_(3)蛋白表达升高(P<0.01),p-AMPK蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠血清TC、LDL-C水平降低(P<0.01),优甲乐组和联合用药组TG水平降低(P<0.01),半硫丸各组肾周脂肪组织PPARγmRNA表达以及TSHR、PPARγ蛋白表达降低(P<0.01),p-AMPK蛋白表达升高(P<0.01),各给药组GPAT_(3)mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论半硫丸可能通过调控TSHR介导的AMPK/PPARγ/GPAT_(3)信号通路改善甲减导致的脂质紊乱,这种机制与优甲乐不同。

芍药属牡丹组(Paeonia sect.Moutan)种间关系的分子证据:GPAT基因的PCR-RFLP和序列分析

为了探讨芍药属牡丹组Paeoniasect.Moutan的种间关系 ,对采自 1 5个野生居群 ,代表牡丹组全部 8个野生种的 1 5份材料的GPAT基因片段 (外显子 5和 6之间 2kb的内含子 )进行了PCR_RFLP分析 ,并对代表牡丹组全部 8个野生种的 9份材料进行了测序。根据 1 2个限制性内切酶的PCR_RFLP数据 ,使用Network 3 .0计算机程序的RM (reduced_median)法建立了牡丹组种间亲缘关系网络树。同时根据 8个种 9份材料的GPAT基因片段序列 ,利用PAUP 4.0计算机程序建立了牡丹组GPAT基因的最大简约(MP)树和邻接 (NJ)树。结果获得了具有很高自展值支持、分辨良好的牡丹组种间关系 (GPAT基因 )树。最重要的是 ,该基因树所显示的牡丹组种间关系与根据形态学证据提出的牡丹组的种间关系基本吻合 ,并得到其他研究证据的支持。根据这一结果 ,对牡丹组的种间关系进行了详细的讨论。

冷胁迫下王百合GPAT基因保守区克隆及表达分析

以王百合为试验材料,通过同源克隆和巢式PCR方法从4℃低温诱导的王百合试管苗中分离得到了王百合GPAT基因的保守区序列,采用DNAman软件和BLASTN对该序列进行分析并分别从蛋白和基因角度分析了GPAT基因在4℃冷诱导情况下的表达情况.结果显示:(1)该保守区长744 bp,推测其编码247个氨基酸,氨基酸序列存在1个高度保守的区域(WIAPSGGRDRP),经过Blast比对分析发现,该保守区序列为LPLAT基因超级家族酶类的催化活性区,此家族多为催化酰基辅酶A(acylCoAs)或者酰基载体蛋白(acylACPs)中的酰基与受体蛋白结合的酰基转移酶类.(2)冷诱导促进GPAT基因的表达,随冷诱导时间延长,基因表达量不断增大,诱导4 h有大量表达,16 h表达量达到最高,16 h之后表达量随着冷诱导时间的延长逐渐下降,72 h时的表达量与0 h处理时基本一致.研究表明,GPAT在百合抵抗冷胁迫的过程中具有重要的作用.

冷诱导下毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性变化及其基因保守区的克隆

探讨了野生毛百合甘油-3-磷酸酰基转移酶活性在冷胁迫下的变化,用简并引物扩增了甘油-3-磷酸酰基转移酶基因保守区序列的结果表明,该保守区段长744 bp,推测编码247个氨基酸。在GPAT氨基酸序列中存在1个高度保守的区域(WIAPSGGRDRP),在NCBI上经过BLASTp比对分析,发现这段保守区序列为LPLAT基因超级家族酶类的催化活性区,此家族多为催化酰基辅酶A(acylCoAs)或者酰基载体蛋白(acylACPs)中的酰基与受体蛋白结合的酰基转移酶类。此序列Genbank登录号为HQ654523。

GPAT基因表达载体的构建及对非洲菊的遗传转化

运用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶(GPAT)基因构建表达载体,将GPAT和QS115质粒中的诱导型启动子串联后,插入带有终止子PinⅡ的表达载体pCAMBIA1300质粒中。并用PCR和酶切等多种方法进行鉴定。构建后的载体经PCR和酶切鉴定表明目的基因和启动子均已按预计方式插入载体的指定位置。用农杆菌介导的方法将它们转化到非洲菊中,获得了潮霉素的抗性植株,并通过PCR扩增验证,有抗性苗含有这个抗冷基因。

水稻中编码甘油-3-磷酸转酰酶部分cDNA的克隆及序列分析

参照国外报道的几种双子叶植物的甘油－３－磷酸转酰酶的相对保守的氨基酸序列，设计并合成一对简并引物，提取抗冷性强的水稻品种“丽梗２号”的ＲＮＡ，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，扩增出了３１５ｂｐ的一段ｃＤＮＡ片段。扩增产物经纯化后直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统中，经ＰＣＲ法鉴定，所得的重组质粒中含有３１５ｂｐ的片段。证明已克隆到水稻甘油－３－磷酸转酰酶部分ｃＤＮＡ。采用双链双脱氧法定序分析，表明所克隆的该段ｃＤＮＡ序列与国外所报道的双子叶植物的该段ｃＤＮＡ的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性均达到７０％以上，提示了该基因在进化上具有一定的保守性。

GPAT/AIRC基因对白耳鸡群体肌肉肌苷酸含量的遗传效应分析

以GPAT/AIRC基因为侯选基因,以白耳鸡为试验材料,采用PCR-SSCP方法对GPAT基因外显子2,AIRC基因外显子8进行SNPs检测。结果各发现了一个单核苷酸多态性位点。各种基因型与胸肌IMP含量的方差分析结果表明:GPAT基因外显子2中AA型个体的肌肉肌苷酸含量显著地高于AB型和BB型个体,AB型个体也稍高于BB型,但差异不显著;AIRC基因外显子8中CG型个体的肌肉肌苷酸含量显著地高于GG型和CC型个体,GG型个体的胸肌肌苷酸含量也显著地高于CC型。两个基因的单倍型对IMP含量也有显著的影响:单倍型为AACG的个体比单倍型为BBCC的个体高1.006 mg/g,单倍型的遗传效应大于最优秀的单个基因型效应。因此,可以利用该单倍型对鸡的肉质风味性状进行标记辅助选择。

柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。

七种不同抗冷性植物甘油-3-磷酸转酰酶m RNA二级结构研究

对南瓜、豌豆、黄瓜、拟南芥菜、红花、菠菜、黑子南瓜等 7种不同抗冷性植物甘油- 3-磷酸酰基转移酶的mRNA序列作了三核苷酸碱基模式分析 ,并用Zuker方法对其mRNA序列的翻译区进行了二级结构分析 ,统计出发夹、内环、膨胀环、三分支环、四分支环等二级结构的基本结构单元数 ,通过对编码脯氨酸的密码子在mRNA二级结构中的分布位置的研究 ,发现这些密码子主要是分布在茎的末端、环的根部、膨胀环或分支环上 ,占到了序列中所有编码脯氨酸的密码子总数的 6 9%到 97%的比例 ,这与我们在研究其他物种的mRNA二级结构时的发现是一致的。

新干特早柚GPAT基因5’端克隆及序列分析

采用5’-RACE技术从新干特早柚(Citrus grandiscv.Xingantezaoyou)叶片中克隆出一条长832 bp的GPAT基因5’端cDNA片段(GenBank登录号:DQ193970)。序列分析结果表明:该cDNA片段序列与其它科属植物的GPAT基因序列的同源性差异较大,除与同类植物——温州蜜柑(Citrus unshiu)的同源性高达98.9%,与红花(Carthamus tinctorius)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、非洲油棕榈(Elaeis guineensis)、豌豆(Pisum sati-vum)、蚕豆(Vicia faba)的同源性分别为62.5%、54.6%、48.2%、47.4%、46.9%;其所编码的氨基酸序列与红花、拟南芥、非洲油棕榈、豌豆、辣椒的同源性分别为51.6%、60%、45.1%、48%、52.3%,与细菌(Bacillusamyloliquefaciens)的同源性仅为18.9%,说明GPAT基因的氨基酸序列具有种属特异性。

用保守氨基酸区段序列分离克隆几种云南高原作物GPAT基因cDNA片段

用分子生物学技术分别成功地从南瓜及黑子南瓜、水稻、油菜中得到了ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ片段中约３１５ｂｐ的片段，并用Ｔ４连接酶分别克隆到了ｐＧＥＭＴ载体系统上。这一片段在不同科的植物中其片段大小并无差别，但限制性酶切表明其内部序列确实存在有差异。从南瓜中得到的ＧＰＡＴｃＤＮＡ部分片段经ＨｉｎｄⅢ酶切，得到了一个约１００多ｂｐ和一个约２００ｂｐ的片段，与前人所发表的南瓜ＧＰＡＴｃＤＮＡ序列（在该片段的１１１ｂｐ处有一个ｈｉｎｄⅢ的酶切位点）相符。

肌苷酸合成酶系3个基因对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的遗传效应

GPAT、AIRC和PURH基因作为肌苷酸合成过程中的酶系基因,它们对鸡肌肉肌苷酸含量均具有显著的效应。为了进一步验证这3个基因对肌苷酸含量的遗传效应,本研究以白耳鸡为试验材料,采用PCR-SSCP和测序相结合的方法,分析了这3个基因的单基因以及合并基因型对鸡胸肌肌苷酸含量的影响。结果表明:GPAT、AIRC和PURH基因均对白耳鸡胸肌肌苷酸含量的差异产生影响,均与鸡肌肉IMP含量存在显著关联(P<0.05),这3个位点可作为影响鸡肌肉肌苷酸含量的分子标记;合并基因型的遗传效应要高于最优秀的单个基因型效应。因此,可以利用合并基因型对鸡的肉质风味性状进行标记辅助选择。

猪GPAT基因SNPs位点分析和表达规律的研究

为了进一步探索谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶GPAT基因与肉质、风味性状的关系,采用PCR-SSCP方法分析其遗传多态性、采用Real time PCR方法分析其组织表达规律。在外显子1和14寻找到了3个单核苷酸多态位点,结果表明,各等位基因在民猪、大白、长白、杜洛克、北京黑猪和野家杂交猪中的分布存在着极显著的差异(P<0.01)。GPAT在所检测的12种组织中均表达,其中肝脏中表达量最高。研究结果为肉质和风味性状分子标记的确定提供了基础。

柑橘类植物和其它植物的GPAT和SOD基因分子进化分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因和超氧化物歧化酶(SOD)基因是与植物抗寒和抗逆密切相关的2个基因。为了研究柑橘类植物之间以及和其它植物之间上述两基因的分子进化的异同,已经获得的数种柑橘类植物的GPAT基因、SOD基因氨基酸序列和通过检索GenBank数据库获得的相关序列为试验数据,使用PAUP4.0软件,通过最大简约法,分别构建GPAT基因、Fe/Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和总SOD基因的分子系统进化树。GPAT基因分子系统进化树分析结果表明,GPAT基因在单子叶和双子叶植物中的进化差异不大,在柑橘类植物中的进化差异较大;Fe/Mn-SOD基因分子系统进化树分析结果表明,该基因分子进化与植物自身的抗逆能力有密切关系;Cu/Zn-SOD基因分子系统进化树分析结果表明,该基因在进化上是相当保守的。总SOD基因分子系统进化树分析结果表明,SOD基因的进化和聚类并不是以植物的科属是否相同或相近为依据的,而是以该基因所结合的金属离子的不同来分类的;Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因来源于不同的祖先基因,前者较后者保守。

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 6,GPAT6)基因长1 110 bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上。重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征。

PBI121/GPAT质粒的构建及对非洲菊转化

为提高植物抗寒性,本文构建一个植物表达载体,并对非洲菊进行转化。用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶(GPAT)基因构建表达载体,将GPAT插入表达载体pB I121质粒取代该质粒上原有的GUS基因,并用PCR和酶切进行鉴定。用农杆菌介导的方法将该质粒转化到非洲菊中。结果表明该植物表达载体构建成功,同时对非洲菊高效转化体系进行探索,获得卡那霉素抗性苗7苗。