香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2。这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强。对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件。将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱。

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。

毛柄金钱菌gpd启动子驱动福寿螺纤维素酶基因在灰盖鬼伞菌中的表达

为研究毛柄金钱菌gpd启动子驱动福寿螺纤维素酶基因(mfc)在大型丝状真菌中的表达效果,本实验通过构建毛柄金钱菌gpd启动子驱动的mfc基因的真核表达载体,采用PEG(polyethylene glycol)介导法将目的基因重组进色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞菌染色体,对转化子进行PCR、Southern blotting、RT-PCR等分子鉴定,通过测定滤纸酶、CMC酶和木聚糖酶的活力考察mfc的表达效果。结果表明:多功能纤维素酶基因整合入灰盖鬼伞基因组中,毛柄金钱菌gpd启动子能够高效驱动mfc基因的表达,其中酶活力最高的工程菌株为Cfvlm9,其滤纸酶活力、CMC酶活力和木聚糖酶活力分别为21.5、44、235U/mL,分别是对照的1.79倍、1.6倍和2.97倍。

草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。[方法]采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。[结果]从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。[结论]该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。

姬松茸(Agaricus blazei Murrill.) gpd启动子的克隆及其序列分析

[目的]对姬松茸中分离的gpd启动子片段进行序列分析。[方法]根据报道的gpd启动子序列设计合成1对引物,以姬松茸基因组DNA为模板,采用PCR扩增法克隆得到了2条DNA特异性片段,并利用启动子信号扫描和启动子预测程序对2条序列的片段启动子区和转录结合位点进行分析。[结果]测序结果表明,2条序列分别为372 bp和614 bp,分别命名为J-gpd1和J-gpd2,GenBank登陆号分别为:EU220746和EU220747;J-gpd1有3个,J-gpd2有4个核心启动子区;2条序列不仅具有基本启动子作用元件CAATBOX和TATABOX外,还具有多个重要作用元件,如CGCGBOX、GATABOX、ASF-motif、W-BOX、TGACGT-motif和GTGA motif等。利用TFSEARCH ver.1.3分析表明,2条序列还含有多个转录因子结合位点,包括GCR1、ADR1、HSF、ABF1和RAP1等。[结论]研究推测,2条序列所启动的基因具有较高的多样性和准确性。

香菇gpd启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体的构建

根据Genbank中提交的云芝(Coriolus versicolor(L.)Quel.)漆酶(lcc1)基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR获得云芝漆酶基因cDNA完整编码框,与GenBank中云芝漆酶基因同源性为96%;以pCAM-BIA1381xb为初始载体,利用引物两端的酶切位点,将克隆得到的云芝漆酶基因cDNA序列分别连接到香菇gpd启动子Lg1和Lg2的下游,构建成香菇启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体pC-XG1-YZ-Lac和pC-XG2-YZ-Lac,利用冻融法将其转到了农杆菌EHA105中。

暴马桑黄gpd启动子的克隆与序列分析

暴马桑黄药用价值很高,但是其含有的一些药用成分含量很低,运用基因工程技术对暴马桑黄进行改造,是培育优质暴马桑黄的有效手段。本试验对暴马桑黄三磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)启动子进行基因克隆,从暴马桑黄中克隆得到一段1380 bp的gpd启动子序列。核心启动子区是转录因子和RNA聚合酶的结合区域,对启动子活性有较大影响,序列分析发现gpd启动子在995-1045 bp之间是核心启动子区的概率最高(0.99);作用元件预测结果显示,gpd启动子含有CAAT-box、TATA-box等典型的启动子顺式作用元件,以及参与低温响应的顺式作用元件LTR、参与脱落酸反应的顺式作用元件ABRE等多种重要的作用元件;启动子序列中处于非甲基化状态的CpG岛是基因转录所必需的,经过预测发现gpd序列在7-1380 bp之间存在一个CpG岛;此外在该启动子序列中还发现AP1、MAF等多种转录因子的结合位点,这些位点是启动子上与转录因子相结合的DNA片段,是一些转录开始的关键结合部位。结论:通过以上结果初步判断克隆得到的gpd启动子具有调控外源基因表达的能力。

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf(615bp)启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测,结果表明:灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。

PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达

利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因工程菌分别在0.2,0.5,1.0 mol/L NaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。

金针菇启动子的基因克隆

利用PCR扩增技术,以金针菇菌丝总DNA为模板,扩增出一条长约750 bp的特异性gpd启动子基因条带(命名为gpd-Fv2),并将其连接到载体上,然后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选出阳性质粒。DNA序列与金针菇gpd启动子的同源性为98%。

根癌农杆菌介导的双孢蘑菇转基因体系的建立

构建了gpd启动子驱动的双孢蘑菇(Agaricus bisporus)双元表达载体,研究了受体材料、农杆菌浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度和共培养时间对转化效率的影响。结果表明:不同受体的转化效率有较大的差异;以直径2~4 cm的菌丝球为受体,当农杆菌菌液D600为0.2,侵染时间30 min,共培养AS浓度为200μmol·L^-1,共培养1 d时,获得抗性转化子的百分率最高,为56.8%。拟转化子的PCR鉴定和GUS(β-glucuronidase,GUS)染色验证外源基因已整合到双孢蘑菇基因组并得到稳定表达。