GPD1酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的构建可以分泌表达GPD1酶的毕赤酵母,并使用Profinia蛋白纯化系统获得纯度90%以上的GPD1酶,扩大GPD1酶的制备,以进一步研究其在肿瘤中的功能及作为抗肿瘤靶点的临床应用研究。方法提取人细胞的总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板通过PCR扩增GPD1基因,PCR产物与表达载体pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,连接构建重组表达质粒pPICZα-C-gpd1;pPICZα-C-gpd1质粒电转至毕赤酵母X-33中,筛选阳性转化子,经甲醇诱导表达,采用固化金属亲和层析(IMAC)纯化分泌的目的蛋白。结果经SDS-PAGE鉴定,成功表达和纯化了GPD1酶,纯度达90%以上。结论本研究建立了毕赤酵母分泌表达GPD1酶的方法,可用于制备GPD1酶,为进一步的肿瘤机制研究和应用研究奠定基础。

种子特异启动子的GPD1基因植物表达载体构建

利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和酵母INVSc1(Saccharomyces cerevisiae)的基因组DNA中分别扩增获得种子特异启动子napin和3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)基因片段,并将它们分别克隆到pMD18-T载体中。利用中间载体pBluescriptKS将两目的片段插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的GPD1基因植物表达载体p1390NG,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。