GPI锚——一种复杂的蛋白质翻译后修饰

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins,GPI-APs)是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质,最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区,通过翻译后修饰产生的GPI结构锚定在细胞膜上.GPI锚结构复杂,由磷酸氨基乙醇联结部、核心糖链和磷酸肌醇尾组成.核心糖链中的甘露糖、葡萄糖胺、磷酸肌醇残基可不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰.尽管被精确解析出的GPI锚结构还较少,但已在分子水平上证明GPI锚具有非常多样的生物学功能,如信号传导、细胞黏附、蛋白质转运和免疫反应等等.近年来,由于实验技术的进步,GPI锚的相关研究也在逐步深入.对GPI锚独特的翻译后修饰及其功能的最新研究进行分析归纳.

GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达

目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上GPI锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果:构建了阅读框完整的GPI锚固型Met-RANTES嵌合分子,经测序是正确的,并在CHO-DHFR-细胞膜上稳定表达。结论:在CHO细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白,GPI锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中,抑制移植排斥反应。

溶组织内阿米巴:Gal/GalNAC凝集素轻亚单位上GPI锚信号序列的缺失阻止其组装成凝集素异二聚体

溶组织内阿米巴滋养体具有粘附依赖性的溶组织细胞作用。这种粘附作用由滋养体表面半乳糖和N-乙酰半乳糖胺(Gal/GalNAC)特异性的凝集素所介导。该凝集素由170 kDa的重亚单位(Hg1)和30-35 kDa的轻亚单位(Lg1)通过二硫键连接的异二聚体。

Pig-a基因突变试验研究进展

Pig-a基因突变试验是利用流式细胞术或有限稀释克隆法检测细胞表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚链蛋白的缺失情况,并以Pig-a基因突变率的变化来评价受试物的遗传毒性。该试验能够跨物种跨组织检测体内多种类型的突变作用,并能有效整合至其他体内重复给药毒性试验实现多终点联合检测,在药物临床前安全性评价中具有非常广阔的应用前景,有望成为体内遗传毒性试验的新选择,从而弥补现有遗传毒性试验组合的不足。本文对Pig-a基因突变试验的研究进展等进行综述。

西伯利亚蓼几丁质酶基因Class IV克隆及生物信息学分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的几丁质酶(CHI)基因的部分序列,采用RACE技术克隆了具完整编码区的cDNA序列,基因全长1 017 bp,开放阅读框编码270个氨基酸。序列分析表明,该基因的编码蛋白(PsCHI1)以前体形式存在,N端分别有22个氨基酸的信号肽和35个氨基酸的几丁质结合域(CBD),C端199个氨基酸为催化区(CD),连接CBD与CD的14个氨基酸为可变交联区,成熟蛋白为不含信号肽部分,呈碱性,带正电荷。PsCHI1与所选其它植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性(53%～69%),而与classⅠ和classⅡCHI的氨基酸序列同源性较低,推测为植物classⅣCHI。根据日本水稻CHI晶体结构构建了PsCHI1三维分子模型,分析显示PsCHI1可以识别比classⅠ和classⅡCHI短的几丁质片段,并以其它植物CHI的已知结构域和功能为基础,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗病原微生物的功能。

重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3 T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。

冰核蛋白糖脂复合物的组装及其应用进展

本文根据近二十年来国内外在冰核活性蛋白方面研究的报道与成果,以真核生物细胞的GPI(Glycosylphatidylinositol,简称GPI)锚体系作为参考,主要针对冰核蛋白糖脂复合物的组成成分,在论证建立冰核蛋白糖脂复合物的组装过程的机制及表现出生物冰核活性所需的结构特征等方面进行了较为系统的综述,这对冰核蛋白的深入研究具有重要的意义。

烟曲霉蛋白质分泌载体的构建及酸性磷酸酯酶的细胞定位

【目的】在酵母细胞中蛋白质的糖基磷酸肌醇化(GPI)修饰是将GPI定位于细胞膜或细胞壁的信号。目前已对酵母GPI蛋白的细胞定位信号有一定了解,但对丝状真菌GPI蛋白的定位则了解甚少。AfPhoA是丝状真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的酸性磷酸酯酶,是GPI修饰的蛋白。该蛋白首先分离自细胞膜,随后又发现该蛋白与细胞壁结合。分析其C-端序列也未发现已知的定位信号,因此目前还不能确定其细胞定位。【方法】我们以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子,将AfPhoA的C-端序列与GFP的C-端融合后检测融合GFP的细胞定位【。结果】我们用烟曲霉几丁质酶AfChiB1的启动子和N-端信号肽构建了可在烟曲霉中分泌表达GFP的表达载体pchiGFP。在此基础上将AfPhoA的C-端与GFP融合,融合质粒与pCDA14共转化烟曲霉后筛选到一株转化子。该转化子可表达融合GFP,在诱导和非诱导条件下,融合GFP均主要分布在细胞膜上,随培养时间的延长,融合GFP在细胞壁上也有少量分布;在培养上清液中只能检出约30KD的GFP融合蛋白,而没有完整的GFP融合蛋白,推测为从GPI锚上水解释放的。【结论】我们的研究结果表明,AfPhoA蛋白GPI修饰的作用是使该蛋白定位于细胞膜。本研究不仅初步确定了AfPhoA蛋白GPI修饰的细胞膜定位功能,而且为烟曲霉基因与蛋白质功能的研究建立了一个有效表达系统。

拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位

为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan-protein,AGP)的亚细胞定位,克隆了这个基因的编码区,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体,经农杆菌介导转化烟草BY-2悬浮细胞.利用激光扫描共聚焦显微镜,在稳定转化的BY-2细胞表面观察到绿色荧光.研究结果表明,此AGP分布在细胞膜表面.