数据驱动的人体正常和癌症组织中糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-AP)相关基因表达谱的综合分析

人体细胞中含有超过146种GPI锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein,GPI-AP),包括受体、配体、粘附分子和酶等。这些蛋白通过GPI锚定在细胞膜表面的脂筏中,发挥多种重要生物学功能。目前,已经对GPI锚定蛋白的生物合成开展了大量研究,其中GPI-AP的生物合成包括至少20步反应,已鉴定出超过40个GPI-AP合成相关基因,但是仍缺乏对于GPI-AP相关基因在正常组织与癌症组织中表达调控的研究。本研究利用来自于TCGA数据库和GTEx portal的基因表达数据,同时结合使用GlycoMaple糖基化通路分析工具,对正常组织与癌症组织中参与GPI-AP合成和编码GPI-AP的基因的表达情况进行了全面分析。研究发现,与正常组织相比,在早期胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胰腺癌、睾丸生殖细胞癌、原发性皮肤黑色素瘤和转移性皮肤黑色素瘤中,参与GPI-AP合成的基因表达发生了显著变化,其中PIGY在这6种癌症中表达量均有上升。此外,GPI锚定蛋白编码基因CD14在这6种癌症中的表达量上升。GPI锚定蛋白编码基因GAS1、GPC2、GPC4仅在早期胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤中表达量上升,说明部分GPI锚定蛋白如GAS1等可以作为早期胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤生物标志物。本研究为GPI-AP相关基因在正常组织与癌症组织中的表达情况提供了新的见解,为GPI-AP作为生物标志物的开发打下了坚实基础。

脂筏的结构与功能

脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质及蛋白质的微区 .小窝是脂筏的一种类型 ,由胆固醇、鞘脂及蛋白质组成 ,以小窝蛋白为标记蛋白 .脂筏的组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构象转化 ,可以参与信号转导和细胞蛋白质运转 .一些感染性疾病、心血管疾病、肿瘤、肌营养不良症及朊病毒病等可能与脂筏功能紊乱有着密切的关系 .

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的 选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD4 6和CD5 5 ,设计构建了新型的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子。方法 以CD4 6cDNA和CD5 5cDNA为模板 ,通过PCR及PCR重叠延伸技术 (SOE)得到CD4 6 /CD5 5嵌合cDNA。为避免双分子连接后的空间结构和功能的变化 ,在CD4 6与CD5 5之间引入了多肽氨基酸接头 (Linker) ,然后克隆构建GPI锚固型CD4 6 /CD5 5 BluescriptM13克隆载体。结果 获得了阅读框完整、连接部位正确的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子cDNA。结论 本研究为研制开发新一代的多功能。

华支睾吸虫含串联重复序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析

目的通过免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ-ZAP cDNA表达文库和EST数据验证,寻找新的抗原基因,并对其免疫学特征进行初步鉴定。方法使用华支睾吸虫病患者混合血清筛选获得阳性噬菌体克隆,测序后与EST数据进行比对,逆转录PCR(RT-PCR)获得Cs22全长基因序列。PCR跳跃技术获得重复序列次数为2和3次的cDNA片段,将含成熟肽和串联重复序列部分分别克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,转化至宿主菌后,诱导表达获得重组蛋白rCs22-2r、rCs22-3r、rCs22M-2r和rCs22M-3r,使用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化。ELISA法鉴定重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫原性;检测35份华支睾吸虫虫卵粪检阳性的患者血清,15份日本血吸虫病、15份卫氏并殖吸虫病和13份猪囊尾蚴病的患者血清以及31份健康人血清,评价重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫学诊断价值。使用仅含串联重复多肽序列部分重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r,ELISA法分别检测华支睾吸虫病患者和健康人混合血清的特异性抗体,初步确定抗原决定簇位置。结果获得华支睾吸虫Cs22抗原基因的全长序列,其含有EQQDGDEEGMGGDGGRGKEKGKVEGEDGAGEQKEQA 36个氨基酸组成的串联重复多肽序列,共重复13次。生物信息学分析表明,Cs22蛋白为GPI锚定蛋白。ELISA结果显示,重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r具有一定的免疫原性;ELISA检测血清特异性抗体结果显示,华支睾吸虫病患者血清和健康人血清的阳性率均分别为45.7%(16/35)和3.2%(1/31),与日本血吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病患者血清仅1份有交叉反应。ELISA法检测重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r结果显示,两者能区分华支睾吸虫病患者血清与健康人血清。结论获得华支睾吸虫Cs22抗原基因全长序列,其重组抗原蛋白具有一定的免疫学诊断价值,抗原决定簇位于串联重复多肽。

超抗原SEA的GPI锚定修饰和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 ,是研究治疗性肿瘤疫苗的一种有潜力的新策略。通过将从衰变加速因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与SEA嵌合 ,获得了GPI修饰的SEA分子 ,构建的真核表达载体pCI GPI-SEA ,用脂质体方法转染到CHO dhfr-细胞中 ,并用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选 ,细胞免疫荧光分析证实 ,SEA能够在细胞膜上表达。上述GPI锚定修饰的SEA ,可用于进一步研究治疗性肿瘤疫苗。

细胞表面工程与肿瘤疫苗

细胞表面工程 ,又称GPI锚定蛋白转移法 ,是一种不依赖基因转移而能够在细胞膜上表达新蛋白的有效方法。GPI锚定蛋白可以通过其尾部脂质GPI结构自然地整合到细胞膜上。这种方法克服了基因转移技术的一些局限 ,在临床应用上更具优势。该技术可用于肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗方面的研究 ,将GPI锚定修饰的免疫分子直接转移到肿瘤细胞膜上 。

白假丝酵母菌GPI锚定蛋白的研究进展

GPI锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein)是白假丝酵母菌重要的细胞表面蛋白,对白假丝酵母菌的黏附、形态转换和细胞壁合成等有着重要影响。近年来,随着对白假丝酵母菌研究的深入,GPI锚定蛋白越来越多的重要功能逐渐被发现。本文从白假丝酵母菌GPI锚定蛋白的概念入手,从家族分类和功能分类两个角度对GPI锚定蛋白的研究现状进行综述,并对GPI锚定蛋白未来的研究方向进行展望。

体外转运红细胞囊泡的GPI锚定蛋白CD59保护阵发性睡眠性血红蛋白尿症红细胞<英文>

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种后天获得性克隆溶血疾病,由于血细胞膜上缺乏具有调节蛋白补体的GPI-锚定蛋白如CD59和CD55等,所以对补体敏感,易产生溶血。红细胞存储或ATP耗空时有囊泡释放,经免疫印迹试验证明囊泡中富含CD59。应用免疫亲和层析柱分离PNH CD59^-红细胞,然后与红细胞囊泡保温,保温后分别测定PNH CD59^-细胞表面CD59含量和溶血度。用流式细胞仪测定CD59,结果发现保温后CD59含量增加;用蛇毒因子溶血试验测得溶血度有显著下降。体外实验证明囊泡上的CD59可以转运到PNH CD59^-红细胞上,并具有抑制补体溶血的功能,使PNH CD59^-红细胞在受补体攻击时不易溶血。

GPI锚——一种复杂的蛋白质翻译后修饰

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins,GPI-APs)是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质,最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区,通过翻译后修饰产生的GPI结构锚定在细胞膜上.GPI锚结构复杂,由磷酸氨基乙醇联结部、核心糖链和磷酸肌醇尾组成.核心糖链中的甘露糖、葡萄糖胺、磷酸肌醇残基可不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰.尽管被精确解析出的GPI锚结构还较少,但已在分子水平上证明GPI锚具有非常多样的生物学功能,如信号传导、细胞黏附、蛋白质转运和免疫反应等等.近年来,由于实验技术的进步,GPI锚的相关研究也在逐步深入.对GPI锚独特的翻译后修饰及其功能的最新研究进行分析归纳.

棉铃虫幼虫中肠非糖基磷酯酰肌醇锚着氨肽酶N基因的克隆和测序

通过对棉铃虫Helicoverpaarmigera(H櫣bner)幼虫中肠氨肽酶N的克隆和测序,鉴定了1个氨肽酶N基因APN1,其cDNA序列具有3220个核苷酸,具有3042bp的开放阅读框,编码产生1014个氨基酸的蛋白质。其推定的氨基酸序列具有氨肽酶N所共有的锌结合模体HEXXHX18E和N末端20个氨基酸的疏水性信号序列,但C末端没有糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚添加信号序列。该氨肽酶N的cDNA序列已提交GenBank,登录号为AY358034。

人血清中糖基磷脂酰肌醇－特异性磷脂酶D活性的测定

我们用含糖基磷酯酰肌醇疏水膜锚结构（ＧＰＩ－ａｎｃｈｏｒ）的碱性磷酸酶（ＡＬＰ）作为底物，建立了稳定可靠的测定血清中ＧＰＩ专一的磷酯酶Ｄ（ＧＰＩ－ＰＬＤ）活性的条件，活性用ＡＬＰ由疏水性到亲水性的转化率（％）表示。经测定，健康人群的活性水平在转化率为２０～６０％之间者占９５％以上，低于２０％者仅占０．９％。在普查了多种疾病患者血清的酶活性的基础上，统计了几种疾病患者血清的酶活，其中肾衰、肠癌、肝癌、肝硬化以及甲型和乙型肝炎病人血清的酶活有所下降，活性低于２０％者较正常人高１５至４０倍，而急性肝炎恢复期的病人，酶活水平恢复正常。另外发现，高血脂患者的酶活性则明显高于对照值。造成血清中ＧＰＩ－ＰＬＤ活性水平改变的原因尚不清楚，但可能不是由单一器官功能不全所致。

西伯利亚蓼几丁质酶基因Class IV克隆及生物信息学分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的几丁质酶(CHI)基因的部分序列,采用RACE技术克隆了具完整编码区的cDNA序列,基因全长1 017 bp,开放阅读框编码270个氨基酸。序列分析表明,该基因的编码蛋白(PsCHI1)以前体形式存在,N端分别有22个氨基酸的信号肽和35个氨基酸的几丁质结合域(CBD),C端199个氨基酸为催化区(CD),连接CBD与CD的14个氨基酸为可变交联区,成熟蛋白为不含信号肽部分,呈碱性,带正电荷。PsCHI1与所选其它植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性(53%～69%),而与classⅠ和classⅡCHI的氨基酸序列同源性较低,推测为植物classⅣCHI。根据日本水稻CHI晶体结构构建了PsCHI1三维分子模型,分析显示PsCHI1可以识别比classⅠ和classⅡCHI短的几丁质片段,并以其它植物CHI的已知结构域和功能为基础,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗病原微生物的功能。

重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3 T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。

GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达

目的:在仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中高效表达糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型Met-RANTES。方法:构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFR-细胞,氨甲喋呤(MTX)筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上GPI锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果:构建了阅读框完整的GPI锚固型Met-RANTES嵌合分子,经测序是正确的,并在CHO-DHFR-细胞膜上稳定表达。结论:在CHO细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白,GPI锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中,抑制移植排斥反应。

冰核蛋白糖脂复合物的组装及其应用进展

本文根据近二十年来国内外在冰核活性蛋白方面研究的报道与成果,以真核生物细胞的GPI(Glycosylphatidylinositol,简称GPI)锚体系作为参考,主要针对冰核蛋白糖脂复合物的组成成分,在论证建立冰核蛋白糖脂复合物的组装过程的机制及表现出生物冰核活性所需的结构特征等方面进行了较为系统的综述,这对冰核蛋白的深入研究具有重要的意义。

IL-18-GPI融合蛋白的表达及其免疫增强作用的研究

目的:构建真核表达IL-18-GPI融合基因的表达载体,观察融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达动力学及生物学活性,为进一步研究细胞因子作为免疫增强剂在临床肿瘤治疗中的应用奠定基础。方法:通过RT-PCR的方法从脂多糖刺激的外周血淋巴细胞中钓取IL-18基因,通过共用限制性酶切位点与GPI相连形成pcDNA-IL-18-GPI真核表达质粒。将质粒转染CHO细胞后建立稳定表达融合蛋白的细胞株用于融合蛋白的提取。对提取纯化的蛋白进行生物学特性、蛋白质转移分析和γ-IFN诱导实验。结果:获得714bp的核酸序列并构建重组质粒pcDNA-IL-18-GPI。SDS-PAGE和West-blot显示在CHO细胞中表达的IL-18-GPI融合蛋白分子量约为27.5kD,该蛋白具有明显的蛋白转移和诱生γ-IFN的作用。结论:IL-18-GPI融合蛋白是一种潜在的肿瘤疫苗增强剂,具有良好的应用前景。

一种精子表面GPI锚定蛋白初步鉴定方法的建立

精子表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白（GPI-Aps）在精子不同阶段都发挥着关键作用．本研究介绍了嗜水气单胞菌毒素（aerolysin）作为生物探针来鉴定精子表面的GPI锚定蛋白．实验依次进行了嗜水气单胞茵培养、毒素提取纯化、多克隆抗体制备以及三明治蛋白印迹验证实验．凝胶蛋白分离实验显示，硫酸铵沉淀加Sephadex G-100层析柱纯化得到了分子质量为45kD高纯度细菌毒素；蛋白印迹实验验证了制备的多克隆抗体的特异性；三明治蛋白印迹结果显示，嗜水气单胞菌毒素能识别出12条精子脂筏提取蛋白条带，其分子质量主要分布在15～130kD之间；Alex488标记的免疫荧光实验显示，嗜水气单胞菌毒素识别的GPI锚定蛋白主要分布在精子头部和尾部．研究结果提示，嗜水气单胞菌毒素能够有效地识别精子表面的GPI锚定蛋白．

脂筏与感染性疾病

脂筏是生物膜中含有特殊脂质和蛋白质的微区,不仅是跨膜信号转导等多种生命活动的重要参与者,而且在感染性疾病的发生和发展中扮演了重要的角色。脂筏是多种病原体进入宿主细胞的位点,支持病毒粒子的组装和出芽,其信号转导功能一方面可以启动宿主细胞的保护性免疫应答,另一方面也被病原体利用,以利于病原体的传播和疾病发生。此外,脂筏在朊蛋白感染、HCV基因组复制、多种细菌毒素作用以及维持疟原虫的胞内寄生生活等方面也都有重要作用。脂筏在感染性疾病中的重要作用提示,它很有可能成为扭转这些疾病发生和进程以及治疗这些疾病的重要入手点。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体研究进展

尿激酶型纤溶酶原激活物受体作为胞外纤溶酶系统的一员，以糖基磷脂酰肌醇锚的形式固定于细胞膜上，它参与了胞外纤溶酶活性的调节，具有内化受抑制的尿激酶的功能；同时参与了胞外信号的传递；另外它对癌症的临床预后及抗癌转移的研究有重要的意义．