活性氧在钙蛋白酶诱导血小板GPIbα酶切中的调控作用

目的探讨活性氧在血小板酶切中的调控作用。方法健康人洗涤血小板N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二硫苏糖醇(DTT)、钙调蛋白酶抑制剂I(CII)和钙蛋白酶抑制剂II(MDL28170)和钙离子载体(A23187)凝血酶、钙蛋白酶活化剂(dibucaine)单独或联合处理。流式细胞仪分别进行血小板内ROS水平的变化和细胞膜表面GPIbα表达量的检测。处理好的血小板进SDS-PAGE电泳,NC膜转膜,用针对GPIbα的抗体SZ-2孵育,用胶片显影结果。SPSS软件对实验数据进行统计分析,不同组之间的比较采用one-way ANOVA进行统计分析,P<0.05表示有统计学差异。结果 1Dibucaine介导GPIbα酶切的同时,引起了血小板ROS水平的升高。2 DTT和NAC能够明显抑制Dibucaine诱导血小板内ROS水平,同时对Dibucaine诱导GPIbα胞外域的酶切产生抑制作用。3钙蛋白酶抑制剂显著降低A23187、凝血酶、Dibucaine诱导活性氧的产生。结论活化的血小板通过产生内源性活性氧诱导血小板GPIbα的酶切,该通路是依赖钙调蛋白酶的活化而实现的。

凝血酶诱导糖蛋白Ibα酶切的分子机制研究

目的探讨凝血酶诱导糖蛋白(GP)Ibα酶切的分子机制。方法取健康志愿者静脉血,分离得到洗涤血小板。洗涤血小板分别与钙离子依赖蛋白酶(calpain)抑制剂、活性氧(ROS)抑制剂、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD-PH)氧化酶抑制剂、线粒体靶向的ROS抑制剂、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)抑制剂、前列腺素E1(PGE1)、解离素-金属蛋白酶17(ADAM17)抑制剂或溶剂对照等预孵育,再与凝血酶(在搅拌或非搅拌条件下)孵育。流式细胞仪检测ROS浓度,Western blot检测GPIbα的酶切和calpain底物talin的酶切。结果 ROS抑制剂二硫苏糖醇(DTT)和calpain抑制剂MDL单独使用时,均部分抑制凝血酶(搅拌条件下)诱导的GPIbα酶切;联合使用时,则完全抑制凝血酶(搅拌条件下)诱导的GPIbα酶切。DTT完全抑制凝血酶(非搅拌条件下)诱导的GPIbα酶切,而MDL没有抑制作用。另外,caspase抑制剂和血小板活化抑制剂(PGE1)不抑制凝血酶诱导的GPIbα酶切。凝血酶(非搅拌条件下)剂量依赖地引起血小板ROS浓度升高;NAD(P)H氧化酶抑制剂抑制凝血酶引起的ROS浓度升高,线粒体靶向的ROS抑制剂则没有抑制作用。结论在搅拌条件下,ROS和cal-pain两条信号通路共同调控凝血酶诱导的GPIbα酶切;在非搅拌条件下,通过NAD(P)H氧化酶产生的ROS调控凝血酶诱导的GPIbα酶切。