表达血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的中国仓鼠卵巢细胞株研究模型的建立

本研究旨在建立表达重组野生型和突变型血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞研究模型,为进行GPIb-Ⅸ生理功能的相关研究奠定基础。从表达野生型或缺失突变型GPIbα的大肠杆菌宿主菌中抽提质粒并用EcoRI酶切鉴定,然后将分别表达GPIbα、GPIbβ和GPIX3种基因的质粒共转染到中国仓鼠卵巢细胞中,通过免疫共沉淀、Western blot和流式细胞仪检测其表达效果。结果表明,转染48小时后,CHO细胞裂解物和细胞表面均可检测到GPIb-Ⅸ复合物的表达。结论:成功构建了表达血小板膜糖蛋白GPIb-Ⅸ复合物的CHO细胞研究模型。

血小板膜受体糖蛋白Ib-IX-V复合物在瞬时转染的HEK293T细胞中的异常表达

血小板膜受体糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-IX-V复合物在血小板活化过程中起到关键作用,因此其结构及功能一直是研究的热点和难点。由于血小板缺乏细胞核,研究者通常需将野生型或突变型的GPIb-IX-V基因转染至其他哺乳动物细胞系中(如CHO、HEK 293T等)以研究其结构与功能,因此GPIb-IX-V复合物在这些细胞系中是否能如实的反映其在血小板中的情况,是决定这些细胞系是否适合GPIb-IX-V复合物研究的关键。本研究通过检测GPIb-IX-V复合物在不同细胞系中的表达情况,明确细胞系差异是否可能干扰复合物的表达,进而找出研究GPIb-IX-V复合物的最适细胞系。在不同种属、不同组织来源的常用细胞系(如CHO、HEK 293T、HeLa等)中单独或共转染GPIb-IX-V复合物的亚基,并用流式细胞术检测GPIb-IX-V复合物在膜表面的表达量。结果发现:CHO细胞在瞬时转染与稳定转染后GPV在细胞膜表面表达依赖于其与GPIb-IX复合物的相互作用,与血小板中的情况一致。相反,在HEK 293T细胞系中,尽管GPIb-IX复合物的表达情况与CHO细胞及血小板中一致,但是GPV在细胞膜表面的表达不再依赖于GPIb-IX复合物;进一步在HeLa、MES13及HUVEC细胞系中的研究发现,GPV可以在HeLa及MES13细胞膜上独立表达,但是在HUVEC细胞表面不表达,提示GPIb-IX-V复合物各亚基之间的依赖性(进而表现为膜表面的表达量)在不同的细胞系中有所不同。结论:本研究为今后对于GPIb-IX-V复合物的研究具有一定的指导意义,尤其是在细胞系的选择上。HEK 293T细胞系极可能对研究结果造成偏倚,因而并非研究GPIb-IX-V复合物尤其是GPV亚基的最佳选择。

凝血IX因子复合物的研制

目的 :提高IX因子复合物的活性收率和IX因子复合物的血栓安全性。方法 :采用国产DEAE sepharosefastflow胶离子交换层析及Ca3(PO4 ) 2 吸附法 ,从新鲜冰冻血浆中直接制备凝血Ⅸ因子复合物。结果 :二步的收率分别为 ( 76 42± 4 48) %和 ( 74 31± 3 17) % ,制品的FⅨ :C的比活比传统Ⅸ因子复合物提高了约 2 0倍。结论

蛋白质与原卟啉Ⅸ及复合物发光机理探讨

对原卟啉Ⅸ（ＰｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎⅨ）与蛋白质结合物的吸收、荧光的激发、发射光谱等的研究，表明了在光作用下，其可见区发光（λｍａｘ６３５ｎｍ左右）与卟啉有关，而紫外区发光（λｍａｘ４２２ｎｍ左右）与蛋白质的色氨酸残基有关，其光谱特性与临床诊断选择的癌固有荧光特征峰基本相符。该研究结果为探讨癌的发光机理积累了有益资料．

凝血酶原复合物的临床应用

在过去的20年中，维生素K拮抗药（ vitamin K antagonist，VKA）的临床应用逐渐增加，从1993年到2008年增加了300％。 VKA能够降低房颤及使用人工心脏瓣膜患者的卒中风险、预防复发性静脉血栓的发生、治疗遗传性凝血障碍［1］。大量临床试验研究结果表明，目前常用的VKA华法林会增加患者的出血风险，每年有1％～3％应用华法林的高危患者发生致命性出血［2］。国际标准化比值（ interna-tional normalized ratios，INR）大于4将增加颅内出血（ intracranial hemorrhage ， ICH ）的绝对风险。 ICH发生后最初20 h内INR持续升高将增加血肿扩大的风险，血肿扩大是导致死亡的独立危险因素［3］。

抗组胺药对慢性荨麻疹患者血浆TAT与FIX水平的影响

目的:观察抗组胺药对慢性荨麻疹(CU)患者血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)与凝血因子Ⅸ(FIX)水平的影响并探讨TAT、FIX与CU发病的关系。方法:用酶联免疫吸附法检测治疗前CU患者、抗组胺治疗症状控制后CU以及健康献血者血浆TAT与FIX的水平。结果:CU患者治疗前的血浆TAT水平(32.13±14.72 ng/mL)明显高于正常对照组(21.94±7.95 ng/mL)(P<0.01),抗组胺治疗症状控制后的血浆TAT水平(26.53±14.43 ng/mL)较治疗前下降,但组间比较无统计学差异(P>0.05);CU患者治疗前的血浆FIX水平(2.32±0.77μg/mL)低于正常对照组(4.25±1.16μg/mL)(P<0.01),抗组胺治疗症状控制后的血浆FIX水平(3.02±1.36 ng/mL)较治疗前升高(P<0.01),但尚低于正常对照组(P<0.01)。结论:CU患者血浆TAT水平升高,FIX水平降低,提示CU患者存在凝血系统激活以及FIX消耗,抗组胺药治疗后CU患者体内凝血状态向正常水平方向改变,但短时间用药症状控制后其凝血状态并不能立即恢复正常水平。

脑出血患者血小板CD42b,CD62p的表达与脑水肿形成的相关性(英文)

目的分析比较脑出血患者与健康人血小板CD42b,CD62p的表达差异及急性期脑出血患者血小板CD42b,CD62p的表达量与脑水肿体积的相关性,探讨急性期脑出血患者血小板表面糖蛋白CD42b,CD62p的表达及其与血肿周围脑水肿形成的关系。方法选自2002-01/08华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科住院治疗的脑出血患者20例。健康者选自2002-01/08华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科住院患者家属,共15例,利用流式细胞术(FCM)测定20例脑出血患者和15例健康人血小板CD42b和CD62p的表达,根据头颅CT测量脑出血患者血肿周围脑水肿带的大小,并对脑出血患者血小板CD42b和CD62p的表达与血肿周围脑水肿带的大小进行相关性分析。结果与健康人犤(9.7±1.1)%,(81.6±3.1)%犦比较,急性期脑出血患者血小板CD42b的表达(74.2±6.4)%减少,CD62p的表达(4.7±4.8)%增加(tCD42b=4.328,P<0.01;tCD62p=4.017,P<0.01);急性期脑出血患者血小板CD42b和CD62p表达量与血肿周围脑水肿带的大小有相关性(rCD42b=-0.489,P<0.05;rCD62p=0.646,P<0.01)。结论脑出血急性期血小板活化,活化的血小板参与了血肿周围脑水肿形成这一病理损伤过程。

第一批人凝血因子浓制剂国家标准品的协作标定

目的标定第一批人凝血因子Ⅸ浓制剂国家标准品。方法用 ＷＨＯ ９６／８５４批人凝血因子Ⅸ国 际标准品标定我国人凝血因子Ⅸ国家标准品，再用此标准品作对照检测国内生产的冻干人凝血酶原复合物，并分 别将标准品置４℃、３７℃和４５℃保存６个月考查其稳定性。结果各项检测指标均达到国家标准品要求，９．３ＩＵ／支； 检测１４批冻干人凝血酶原复合物ＦⅨ效价，其中１１批达到瓶签标示效价的５０％以上；标准品的稳定性良好。结论 已成功地制定第一批人凝血因子Ⅸ浓制剂国家标准品。

CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy与AMI患者冠脉病变程度的关系及对预后的预测价值

目的:分析CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy与AMI患者冠脉病变程度的关系及对预后的预测价值。方法:根据SYNTAX评分,242例行PCI的AMI患者被分为低分组(65例,≤20分)、中分组(106例,21分~31分)和高分组(71例,≥32分),比较各组血浆CD42b、CD62p、hsCRP和Hcy水平。Pearson相关分析上述指标与SYNTAX评分的相关性;比较各组MACCE发生率;以ROC曲线分析上述指标对MACCE的预测价值。结果:与低分组比较,中分、高分组血浆CD42b水平[(87.71±5.94)比(68.93±3.45)比(55.54±4.31)]显著降低,血浆CD62p[(21.63±3.29)比(27.47±3.01)比(37.81±3.78)]和Hcy[(13.14±1.60)μmol/L比(17.31±1.93)μmol/L比(22.30±2.73)μmol/L]水平显著升高,P均=0.001。Pearson相关分析显示血浆CD42b水平与AMI患者SYNTAX评分显著负相关(r=-0.885,P=0.001),血浆CD62p和Hcy水平与SYNTAX评分显著正相关(r=0.799,0.801,P均=0.001)。与低分、中分组比较,高分组MACCE发生率(9.23%、18.87%比35.21%)显著升高,P=0.001,0.014。ROC曲线显示血浆CD42b、CD62p和Hcy预测AMI患者发生MACCE的最佳截断值分别为69.72、28.33和20.77μmol/L,灵敏度分别为64.7%、73.1%和75.2%,特异度分别为69.3%、80.5%和63.8%。结论:血浆CD42b水平和AMI患者SYNTAX评分显著负相关,CD62p及Hcy水平与SYNTAX评分显著正相关,且对预后MACCE事件有一定的预测价值。

血管性血友病因子和血小板表面受体突变的数据库构建及数据分析

背景:血管性血友病因子和血小板表面受体之间的相互作用在血小板黏附、传播、聚集等血栓形成过程中起到关键作用。目前关于血管性血友病因子突变信息的数据库并不完善且血小板表面受体相关的数据库仍未构建。目的:致力于构建血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα相关突变的数据库,以利于相关领域的研究人员快速查找到该分子对的重要突变信息。方法:以数据库Uniprot、VWFdb及文献报道的突变信息为数据源,采用MySQL和Apache为后台数据库和服务器,运用PHP语言开发血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα突变数据库。结果与结论:收集了341条血管性血友病因子,13条血小板糖蛋白Ibα的野生或者突变序列数据,并人工构建A1结构域的虚拟突变3 920条,建立了包括背景介绍、相关病理图册和资料下载等登录页面,初步实现了数据检索、突变位点分析以及虚拟突变位点信息等相关功能。该数据库较全面搜集及分析血管性血友病因子及血小板糖蛋白Ibα的数据信息,有利于研究人员对血管性血友病因子和血小板糖蛋白Ibα相关信息的查询,有助于新型抗血栓药物的研发,进一步提高临床诊断和治疗水平。

辉瑞捐赠200万单位凝血九因子药物

为缓解国内乙型血友病治疗药物凝血酶原复合物的短缺情况,满足血友病患者迫切的用药需求,辉瑞公司于2012年2月9日在北京向中国医学科学院血液病医院捐赠了200万单位凝血九因子药物（注射用重组人凝血因子IX,BeneFIX）。

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备兔抗人血小板膜糖蛋白（GP）IbαC端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体，并初步用于人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状态的检测。方法应用化学方法合成C—R—G-S—L-P（559位丝氨酸非磷酸化，Ser559）和C—R—G—S（P）-L-P（559位丝氨酸磷酸化，pSer559）多肽。将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后，以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔，分离获得2种抗血清（抗Ser559多抗和抗pSer559多抗）。应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对抗血清进行鉴定并检测效价。从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα，利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况。结果所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原，效价分别为1：32000和1：64000。2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合，表明人血小板GPIbα559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态。结论应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗，并证明人血小板GPIbcαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态。

测量血小板膜糖蛋白与血管性血友病因子黏附解离力

本实验用微吸管技术研究血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)与血小板膜糖蛋白(GPIb/IX)之间相互识别、黏附的反应率及两种蛋白黏附之后发生解离时所需要的解离力。利用经过转染可表达人血小板膜糖蛋白GPIb/IX的CHO细胞与包被有VWF的兔红细胞互相接触并施加一定的外界压力,保持压力一段时间之后根据分开两细胞时红细胞变形判断蛋白质识别与否,记录两种蛋白质发生识别黏附的几率。通过对细胞变形的测量和数据处理得出GPIb/IX与VWF识别后的解离力。携带GPIb/IX或VWF的细胞对心挤压0.5μm,持续30s的实验状态下,两个细胞间发生黏附的概率约为15.0%。通过对红细胞形变的分析,得到携带GPIb/IX或VWF的细胞发生黏附后的解离力呈随机分布状态。分布的峰值,即解离力的最大几率值为10 pN。