陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P<0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。

山羊GPR1基因的克隆及表达特征分析

本文旨在克隆山羊GPR1基因,对其进行序列分析,并研究组织表达。以简州大耳羊为试验材料,应用RT-PCR方法克隆山羊GPR1基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR构建组织表达谱。结果表明：山羊GPR1基因编码区长度为987 bp（Gen Bank登录号：KT347601）,编码蛋白为稳定疏水蛋白;存在7个跨膜结构域,在69~304氨基酸序列属于G蛋白偶联受体家族保守结构域（Pfam：7tm-1）;荧光定量PCR分析表明,GPR1在24月龄山羊心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背最长肌、股二头肌和臂三头肌中均有不同程度的表达,其中肺脏中表达量最高且极显著高于其他组织（P〈0.01）,脂肪、脾、肝和心次之,股二头肌中表达量最低;GPR1基因在1~3月龄与24月龄表达变化趋势相同,由背最长肌、股二头肌和臂三头肌呈现逐渐上升的趋势,而8~10月龄则呈现相反的变化趋势。该实验结果为进一步研究GPR基因提供理论基础。

双酚A暴露诱导雌性大鼠性早熟的下丘脑KISS-1和GPR54基因甲基化分子机制探讨

目的探讨双酚A(BPA)暴露诱导雌性大鼠性早熟的下丘脑KISS-1和GPR54基因甲基化分子机制。方法将SD雌性幼鼠(21 d龄)分为4组,即BPA干预组(0.25 mg/kg)、BPA空白对照组(与BPA组同时处死)、17β-雌二醇组(E2,0.1 mg/kg)、溶剂对照组(直至大鼠出现阴道开口再处死),每天以灌胃方式持续给药10 d,以大鼠阴道开口时间(VOD)为观察终点(VOD当天处死),BPA干预组阴道开口当天处死时,按1∶1比例处死BPA空白对照组。收集大鼠卵巢和下丘脑组织,采用real-time PCR方法检测卵巢ERα、ERβmRNA和下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA相对表达水平,焦磷酸测序PCR方法检测KISS-1、GPR54基因甲基化水平。结果BPA干预组和E2组VOD较溶剂对照组提前(P<0.05),BPA空白对照组处死时未出现阴道开口,BPA干预组下丘脑KISS-1、GPR54 mRNA表达水平明显高于BPA空白对照组(P<0.05),但与溶剂对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。E2组下丘脑KISS-1 mRNA和卵巢ERβmRNA表达水平明显低于溶剂对照组(P<0.05)。BPA干预组、BPA空白对照组、E2组和溶剂对照组4组间比较,下丘脑KISS-1基因CpG位点甲基化水平差异无统计学意义,而GPR54基因CpG位点甲基化水平存在显著性差异,其中BPA干预组、E2组和溶剂对照组GPR54片段1 CpG位点甲基化水平显著低于BPA空白对照组(P<0.05),且其甲基化水平与VOD呈正相关(rs=0.245,P=0.009)。BPA干预组GPR54片段2 CpG位点甲基化水平显著低于溶剂对照组,而E2组卵巢ERβ基因甲基化水平显著高于溶剂对照组(P<0.05)。结论BPA暴露可导致雌性幼鼠阴道开口(性早熟)提前,其下丘脑GPR54基因甲基化水平改变可能是毒性机制之一。